研究背景糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是一种特异性心肌病,是导致糖尿病患者晚期死亡的主要原因之一。其主要病理改变是细胞外基质(extracellular matrix, ECM)积聚和心肌间质纤维化。DCM的发病是多种致病因素相互作用的结果,其中心肌局部肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)活性的增高是导致DCM发生发展的重要因素。此外,肾脏局部RAS的异常激活亦是触发糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)的重要致病因素之一。大量研究表明体内多个脏器和组织均存在独立的RAS,称为“局部RAS”或“组织RAS”,如心脏、肾脏、肾上腺、胰腺、中枢神经系统和脂肪组织等。心脏局部RAS,在维持心血管正常结构及功能活动方面起重要作用,同时也参与多种心血管疾病的发病过程,其在心肌肥厚和间质纤维化等方面起着重要的作用。同样,肾脏局部RAS在维持肾脏正常结构及功能的同时,也参与多种肾脏疾病的发生发展。肾内高水平的血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)可以导致基质金属蛋白酶(如MMP-2)的表达及活性降低、生长因子(如TGF-β1、PDGF、VEGF等)生成增加、氧自由基生成增加、ECM合成增加及降解减少,最终导致肾小球及间质纤维化。因此,心脏及肾脏局部RAS的异常是导致心肌及肾小管间质纤维化的重要原因之一。AT1受体拮抗剂(ARBs)可竞争性拮抗AngⅡ与AT1R的结合,阻断AngⅡ介导的一系列病理生理过程。多项研究已证实ARBs能减轻心肌及小管间质纤维化,延缓心衰、肾衰的发生发展。近年来研究表明骨桥蛋白(Osteopontin, OPN)在促进心肌及肾小管间质纤维化中具有重要作用。OPN作为一种强大的巨噬细胞趋化因子,促使巨噬细胞到达肾间质,从而与巨噬细胞表面的OPN受体结合,释放TGF-β1、PDGF、IL-1等细胞因子,分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白、纤维连接蛋白、硫酸软骨素等细胞外基质成分,从而促进小管间质纤维化及肾功能损伤。其次,OPN本身可作为致纤维性细胞因子促进成纤维细胞的迁移、黏附及增殖；OPN可与胶原、纤维连接蛋白及蛋白多糖相互作用,形成稳定的复合物,促进ECM成分的合成及转化,从而促进组织纤维化。此外,研究发现OPN基因的启动子有TGF-β的结合元件,提示OPN可受TGF-β的调控,亦有研究显示OPN受RAS的调节,且参与AngⅡ诱导的纤维化过程。本课题采用链脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)诱导的T1DM大鼠模型作为研究对象,观察不同剂量厄贝沙坦(Irbesartan, Irb)对糖尿病大鼠心脏和肾脏形态的保护作用,以及对心脏、肾脏TGF-β1、OPN的影响,并以肼屈嗪作为降压阳性对照,探讨糖尿病状态下厄贝沙坦是否通过抑制OPN的表达而减轻心肌及小管间质纤维化,从而为减轻糖尿病心肌及小管间质纤维化提供新的治疗策略。具体研究分为以下两个部分：[目的]1、观察不同剂量厄贝沙坦对STZ诱导的糖尿病大鼠心肌间质纤维化、TGF-β1、OPNmRNA表达的影响；2、探讨厄贝沙坦减轻心肌间质纤维化的可能机制及其剂量相关性。[方法]1、糖尿病大鼠模型的制备和分组：63只8周龄雄性Wistar大鼠(购于南方医科大学实验动物中心),体重240-280g。按体重分层后随机数将大鼠分为3组：(1)Ctrl组：正常对照组(n=7)；(2)DM组：糖尿病对照组(n=14)；(3)药物干预组(n=42)。各组大鼠隔夜禁食14-16h后,给予DM组和药物干预组大鼠一次性腹腔注射STZ (55mg/Kg体重,溶于0.1mol/L柠檬酸缓冲液,pH4.5),Ctrl组注射等体积的0.1mol/L柠檬酸缓冲液,72h后尾静脉采血,用快速血糖仪(One touch ultra)测定全血血糖,血糖>16.7mmol/L为糖尿病造模成功。STZ注射后72h内,DM组死亡3只,药物干预组死亡6只。药物干预组糖尿病大鼠按体重再次随机分为4组,于造模成功4周后分别给予25mg/kg·d厄贝沙坦(DM+Irb25组,n=9)、50mg/kg·d厄贝沙坦(DM+Irb50组,n=9)、200mg/kg·d厄贝沙坦(DM+Irb200组,n=9)和30mg/kg·d肼屈嗪(DM+Hyd组,n=9)干预8周。造模后前4周,对血糖值≥30mmol/L的糖尿病大鼠予皮下注射长效胰岛素来得时(Sanofi-anvitis公司,法国),2-4U/隔日,以避免酮症的出现和保持大鼠活力。2、厄贝沙坦(Sanofi-anvitis公司,法国)及肼屈嗪(：Sigma公司,美国)用药根据大鼠体重计算。溶于清洁饮水中灌胃给药,每天一次。正常对照组和糖尿病对照组给予相应体积饮水灌胃。所有大鼠饲养于恒温清洁环境(南方医科大学实验动物中心),自由进食及饮水。3、给药前及给药8周后,采用Powerlab生物信息采集系统(Adinstrument,澳大利亚)测大鼠尾动脉收缩期血压,待大鼠平静后,连续测鼠尾动脉收缩期血压三次,取其平均值为该鼠收缩期血压值。4、标本的留取：给药8周后,大鼠麻醉,经腹主动脉插管取血,立即用4(?)PBS灌注,待PBS颜色澄清后,开胸取心。取0.5×0.5×0.5cm3左室心肌组织,置于10%中性福尔马林缓冲溶液中固定,其余组织立即放入冻存管于液氮中保存。5、心肌组织Masson染色：10%中性福尔马林缓冲溶液固定,常规脱水、浸蜡、包埋。2μm石蜡切片,Masson染色,光镜下观察心肌组织胶原纤维沉积。运用Image-Pro Plus 6.0彩色图像分析系统半定量胶原纤维表达情况。6、心肌组织AngⅡ的测定：从液氮中取出冻存的心肌组织移入1.5ml的EP管中,用冰浴的0.9%生理盐水冲洗,剪碎,加入1mL 0.1 mol/L的醋酸中,用匀浆器制成匀浆,95℃水浴10min,冷却后4℃,15000rmp,离心20 min,吸取上清液。按大鼠血管紧张素ⅡELISA试剂盒说明书进行操作。7、心肌组织TGF-β1、OPNmRNA的测定：Trizol法提取心肌组织总RNA,逆转录试剂盒转录为cDNA。Real-time PCR检测心肌组织中TGF-β1、OPN mRNA表达情况。以β-actin作为内参。8、统计分析：所有数据由SPSS13.0统计软件处理,以均数±标准差(x±SD)表示,符合正态分布和方差齐性时用单因素方差分析(ONE-WAY ANOVA),进一步组间多重比较采用LSD法。不满足方差齐性用Welch法对F值进行校正,进一步多重比较用Dunnett T3法。P<0.05为差异有统计学意义。[结果]1、实验动物特性：实验期间糖尿病大鼠血糖显著升高,表现多尿、多饮、多食、消瘦、背毛粗乱无光等症状。实验期间共死亡大鼠11只,其中DM组4只、DM+Irb25组1只,DM+Irb200组2只,DM+Hyd组3只,死亡原因可能与高血糖诱发酮症有关。DM+Irb50组大鼠灌胃时死亡1只。造模成功后,糖尿病大鼠鼠尾全血血糖值较正常对照组显著升高；除正常对照组外,各组组间血糖值无显著差异(x2=0.412,p=0.981)。干预前后DM组大鼠体重均显著低于正常大鼠(P<0.001)；干预前后,厄贝沙坦和肼屈嗪组大鼠体重与DM组大鼠均无显著性差异(P均>0.05)。2、厄贝沙坦对糖尿病大鼠尾动脉收缩期血压(TCP)的影响：药物干预前,糖尿病大鼠TCP显著高于(P<0.001)正常对照组大鼠。药物干预后,厄贝沙坦、肼屈嗪干预组糖尿病大鼠TCP较干预前均显著降低(P均<0.001)。以干预前血压为协变量,药物干预后各组间糖尿病大鼠TCP有显著差异(P<0.001)3、心肌组织Masson染色：Masson染色中胶原纤维呈蓝色,肌纤维呈红色。正常对照组胶原分布均匀,糖尿病对照组心肌内胶原纤维明显增多、排列紊乱。半定量分析显示糖尿病对照组心肌组织胶原含量显著升高(P<0.001)。给予厄贝沙坦后,心肌内胶原纤维明显减少,且随着剂量的增加而递减(P<0.001)。肼屈嗪干预组,胶原纤维的减少不如50mg/kg·d和200mg/kg·d厄贝沙坦组显著(P<0.001)。4、厄贝沙坦对糖尿病大鼠心脏AngⅡ的影响：糖尿病对照组大鼠心脏AngⅡ水平较正常对照组大鼠显著升高(P<0.001),不同剂量厄贝沙坦干预后,糖尿病大鼠心脏AngⅡ水平显著低于糖尿病对照组大鼠(P均<0.001)。200mg/kg·d厄贝沙坦干预组糖尿病大鼠心脏AngⅡ水平显著低于25mg/kg·d和50mg/kg·d厄贝沙坦干预组(P<0.01)。肼屈嗪干预后,糖尿病大鼠心脏AngⅡ水平亦显著低于糖尿病对照组大鼠(P<0.001)。5、厄贝沙坦对糖尿病大鼠心脏TGF-β1和OPNmRNA表达的影响：糖尿病对照组大鼠心脏TGF-β1、OPN mRNA显著高于正常对照组大鼠(P<0.001)。不同剂量厄贝沙坦干预后,糖尿病大鼠心肌组织内TGF-β1、OPNmRNA显著降低(P均<0.01),200mg/kg·d厄贝沙坦干预组糖尿病大鼠心脏TGF-β1、OPN mRNA水平显著低于25mg/kg·d和50mg/kg·d厄贝沙坦干预组(P均<0.05)。肼屈嗪干预后,糖尿病大鼠心脏TGF-β1、OPNmRNA水平亦显著低于DM组大鼠(P<0.01),但不如200mg/kg·d厄贝沙坦干预组糖降低明显。6、相关性分析：心脏AngⅡ水平与OPNmRNA表达呈显著正相关(R=0.847,P<0.001)；心脏OPNmRNA表达与心肌间质纤维化呈显著正相关(R=0.904,P<0.001)。[结论]1、糖尿病状态下,心脏局部RAS被激活,AngⅡ水平显著升高,给予不同剂量厄贝沙坦干预后,心肌组织AngⅡ水平显著减少,且具有一定的剂量相关性。2、厄贝沙坦可显著减少心肌组织TGF-β1、OPNmRNA表达,从而减轻心肌间质纤维化,这可能是厄贝沙坦改善心室重构的机制之一。3、厄贝沙坦在降压效果劣于肼屈嗪的情况下,减少心肌组织TGF-β1、OPNmRNA表达,减轻心肌纤维化程度显著优于肼屈嗪,提示厄贝沙坦有独立于降压作用之外的心脏保护作用。[目的]1、观察不同剂量厄贝沙坦对STZ诱导的糖尿病大鼠肾小管间质纤维化、TGF-β1、OPNmRNA表达的影响；2、探讨厄贝沙坦减轻肾小管间质纤维化的可能机制及其剂量相关性。[方法]1、糖尿病大鼠模型的制备和分组同第一章2、厄贝沙坦、肼屈嗪灌胃给药同第一章3、标本的留取：给药8周后,大鼠麻醉,经腹主动脉插管取血后,立即用4℃PBS灌注后取肾。迅速剥去肾包膜,纵向剖开肾脏,切取约0.5×0.5×0.2cm3大小的组织,置于10%中性福尔马林缓冲溶液中固定。4、肾组织形态学观察及Masson染色：10%中性福尔马林缓冲溶液固定,常规脱水、浸蜡、包埋。2μm石蜡切片,过碘酸雪夫氏染色(PAS染色),光镜下观察肾组织形态学变化。Masson染色,光镜下观察肾小管间质胶原纤维沉积。运用Image-Pro Plus 6.0彩色图像分析系统半定量胶原纤维表达情况。5、肾组织AngⅡ的测定：从液氮中取出冻存的肾组织移入1.5ml的EP管中,用冰浴的0.9%生理盐水冲洗,剪碎,加入1mL 0.1 mol/L的醋酸中,用匀浆器制成匀浆,95℃水浴10min,冷却后4℃,15000rmp,离心20 min,吸取上清液。按大鼠血管紧张素ⅡELISA试剂盒说明书进行操作。6、肾组织TGF-β1、OPNmRNA的测定：Trizol法提取肾组织总RNA,逆转录试剂盒转录为cDNA。Real-time PCR检测肾组织中TGF-β1、OPNmRNA表达情况。以β-actin作为内参。7、统计分析：所有数据由SPSS13.0统计软件处理,以均数±标准差(x±SD)表示,符合正态分布和方差齐性时用单因素方差分析(ONE-WAY ANOVA),进一步组间多重比较采用LSD法。不满足方差齐性用Welch法对F值进行校正,进一步多重比较用Dunnett T3法。P<0.05为差异有统计学意义。[结果]1、肾脏病理改变：正常对照组大鼠,肾小球、肾小管形态规则,无明显系膜基质增生。糖尿病对照组大鼠肾组织可见肾小球肥大,肾小囊腔成裂隙状,系膜基质轻度增生,增殖的基质呈嗜伊红染色,PAS染色阳性；肾小管上皮细胞肥大,病理染色后呈现空泡和颗粒变性。肾间质有大量淋巴细胞及单核细胞浸润。厄贝沙坦及肼屈嗪干预后,糖尿病大鼠肾脏系膜增生、小管空泡样改变有一定的改善,厄贝沙坦改善较为明显。2、肾组织Masson染色：正常对照组大鼠肾小球及小管间质形态正常,未见胶原纤维沉积。糖尿病对照组肾小球、小管间质有大量胶原纤维沉积,厄贝沙坦及肼屈嗪干预后,纤维化程度显著减轻,50mg/kg·d和200mg/kg·d厄贝沙坦干预组糖尿病大鼠的小管间质纤维化显著轻于25mg/kg·d厄贝沙坦干预组和肼屈嗪组(P均<0.05)。3、厄贝沙坦对糖尿病大鼠心脏AngⅡ的影响：糖尿病对照组大鼠肾脏AngⅡ水平较正常对照组大鼠显著升高(P<0.001),给予不同剂量厄贝沙坦干预后,糖尿病大鼠肾脏AngⅡ水平显著低于DM组大鼠(P均<0.001)。200mg/kg·d厄贝沙坦干预组糖尿病大鼠肾脏AngⅡ水平显著低于25mg/kg·d和50mg/kg·d厄贝沙坦干预组(P<0.05)。肼屈嗪干预后,糖尿病大鼠肾脏AngⅡ水平亦显著低于糖尿病对照组大鼠(P<0.001)。4、厄贝沙坦对糖尿病大鼠肾脏TGF-β1和OPNmRNA表达的影响：糖尿病对照组大鼠肾脏TGF-β1、OPN mRNA显著高于正常对照组大鼠(P<0.001)。不同剂量厄贝沙坦干预后,糖尿病大鼠肾内TGF-β1、OPN mRNA显著低于DM组大鼠(P均<0.01),200mg/kg·d厄贝沙坦干预组糖尿病大鼠肾脏TGF-β1 OPN mRNA水平显著低于25mg/kg·d和50mg/kg·d厄贝沙坦干预组(P<0.05)。肼屈嗪干预后,糖尿病大鼠肾脏TGF-β1、OPN mRNA水平显著低于糖尿病对照组大鼠(P<0.05)。4、相关性分析：肾脏AngⅡ水平与OPNmRNA表达呈显著正相关(R=0.74,P<0.001)；肾脏OPNmRNA表达与小管间质纤维化呈显著正相关(R=0.815,P<0.001)。[结论]1、糖尿病状态下,肾内RAS被激活,AngⅡ水平显著升高,给予不同剂量厄贝沙坦干预后,肾内AngⅡ水平显著减少,且具有一定的剂量依赖性。2、厄贝沙坦可改善肾小球肥大,系膜基质增生,减轻肾小管间质纤维化；减少肾内TGF-β1、OPNmRNA表达,这可能是厄贝沙坦减轻小管间质纤维化的机制之一3、厄贝沙坦在降压效果劣于肼屈嗪的情况下,其保护肾脏结构、减轻小管间质纤维化的作用显著优于肼屈嗪,这提示厄贝沙坦有独立于降压作用之外的肾脏保护作用。