论文部分内容阅读
1.携带sFlt-1基因不同片段的慢病毒载体的构建及表达目的:建立携带可溶性血管内皮生长因子受体-1(sFlt-1)不同基因片段的慢病毒表达质粒,为进一步研究sFlt-1蛋白生物学功能奠定基础。方法:以人新鲜胎盘组织提取的cDNA为模板,分别选取sFlt-1第2-3及第2-4免疫球蛋白样结构编码序列设计引物,进行RT-PCR扩增,制备sFlt-1基因片段sFlt-1(2-3)和sFlt-1(2-4)。扩增片断经限制性内切酶BamHI和SalI双酶切后,插入慢病毒载体pRRL-GFP中,构建慢病毒表达质粒pRRL/sFlt-1(2-3)及pRRL/sFlt-1(2-4),分别与慢病毒包装载体pMDLg/pRRE、包被载体PRSV/REV、pMD2.G共转染人胚肾细胞(HEK293T),获得重组慢病毒Lenti.sFlt-1(2-3)及Lenti.sFlt-1(2-4),并感染人视网膜色素上皮细胞,通过RT-PCR和Western blot检验Lenti.sFlt-1(2-3)及Lenti.sFlt-1(2-4)在人类细胞的表达。结果:经酶切鉴定及基因测序证实pRRL/sFlt-1(2-3)和pRRL/sFlt-1(2-4)的序列与Genebank完全相同,包装成病毒后能有效感染人视网膜色素上皮细胞。结论:本实验成功构建了分别携带sFlt-l基因第2-3和第2-4免疫球蛋白样区域编码序列的慢病毒载体,包装成病毒后能有效感染人类细胞,为今后视网膜新生血管疾病的基因治疗提供了新的可能途径。2.小鼠视网膜新生血管模型的建立及鉴定目的:建立稳定可靠的视网膜新生血管动物模型,为今后探究视网膜新生血管疾病的治疗方法奠定模型基础。方法:将新生C57BL/6J小鼠随机分为正常组和模型组。将模型组小鼠于生后第7天置于75%氧浓度环境,生后第12天返回正常空气中;正常组小鼠则始终置于正常空气环境喂养。至小鼠生后第17天进行心脏荧光素灌注造影视网膜铺片和眼球连续切片苏木精-伊红(H-E)染色鉴定视网膜新生血管生成情况。结果:模型组小鼠心脏荧光素灌注造影视网膜铺片结果显示视网膜中央区域无灌注缺血,另外视网膜有明显的异常表现诸如血管迂曲扩张、荧光渗漏等。眼球连续切片H-E染色发现模型组小鼠视网膜有许多突出内界膜的血管内皮细胞核,计数为平均48.65±6.24个/片/眼,而正常组小鼠为平均0.38±0.21个/片/眼,两组比较P<0.01。结论:氧诱导的视网膜缺血模型可成功诱导小鼠产生视网膜新生血管,可作为今后探究视网膜新生血管疾病治疗方法的可靠动物模型。3.可溶性Flt-1基因不同片段转移对小鼠视网膜新生血管的阻遏作用目的:探究sFlt-1基因不同片段转移对小鼠视网膜新生血管的阻遏作用。方法:建立氧诱导的小鼠视网膜新生血管模型,于小鼠生后第12天进行玻璃体内分别注射慢病毒介导的sFlt-1(2-3)和sFlt-1(2-4),于小鼠生后第17天通过心脏荧光素灌注造影视网膜铺片和眼球连续切片苏木精-伊红(H-E)染色观察并比较两者对小鼠视网膜新生血管的阻遏作用,并通过Western blot和免疫组织化学的方法检测两者对视网膜血管内皮生长因子(VEGF)和VEGF受体-2(KDR/Flk-1)表达的影响。结果:通过荧光素灌注造影视网膜铺片观察到Lenti.sFlt-1(2-3)和Lenti.sFlt-1(2-4)转移后小鼠视网膜新生血管均显著减少,眼球连续切片H-E染色发现Lenti.sFlt-1(2-3)转移较Lenti.sFlt-1(2-4)更能有效地减少突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数。通过Western blot和免疫组织化学的方法检测到视网膜VEGF表达无明显改变,而视网膜KDR/Flk-1的表达下降较显著,并且Lenti.sFlt-1(2-3)的作用较Lenti.sFlt-1(2-4)更明显。结论:慢病毒介导的sFlt-1基因片段转移能够明显阻碍小鼠视网膜VEGF与其功能受体的结合,从而抑制视网膜新生血管的形成。