抑郁症是一类以情绪低落、兴趣丧失、悲观、缺乏主动性、自责自罪等为主要临床表现的精神疾病,严重者可出现自杀念头和行为,全世界每年因抑郁症自杀的死亡人数接近100万。在中国,目前已确诊的抑郁症患者约为3000万人,发病率达到6%,世界卫生组织预测,到2020年抑郁症将成为继高血压之后第二大临床慢性疾病。目前仅一半数量的患者对抗抑郁药有较好反应,70%的患者病情无法得到完全缓解,传统的抗抑郁药的疗效虽值得肯定,但普遍存在起效慢、药效弱、作用时间短的弊端,并且对多数的重度抑郁症患者治疗无效。深化对传统抗抑郁药的作用及其机制的认识,可以为抗抑郁药物的研发提供新的思路。抑郁症涉及多种病理机制,包括传统的单胺类神经递质传导功能缺陷假说,神经营养因子分泌降低假说,下丘脑-垂体-肾上腺轴亢进,氧化应激等。无论在抑郁症患者还是动物模型中,星形胶质细胞的病理学一直都占据着重要地位。星形胶质细胞(Astrocyte)位于神经元和毛细血管之间,其通过调节糖代谢决定神经元的微环境,同时对神经递质(特别是谷氨酸)的摄取,突触的成熟和发展以及血脑屏障的形成均起到决定性作用,它可以分泌多种神经营养因子(包括睫状神经营养因子、神经生长因子、脑源性神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子等)和多种神经元支持物(包括促进轴突生长的糖蛋白、细胞粘附分子、层粘连蛋白等),对神经元起着分隔和营养支持的作用。抑郁症患者尸检结果显示在大脑皮层胶质细胞密度明显降低,并伴随着星形胶质细胞标记物的减少,同时在抑郁症模型中发现海马或前额皮层GFAP的表达或GFAP阳性细胞数均显著下调,星形胶质细胞大量萎缩,进一步说明星形胶质细胞功能障碍可能是抑郁症重要的病理机制。然而,抑郁症病理进程中星形胶质细胞大量死亡和萎缩的机制尚不明确。自噬(Autophagy)是细胞自我降解的过程,通过去除错误折叠或聚集的蛋白以及损伤的细胞器减少细胞的坏死和凋亡。然而,抑郁症病理进程中是否发生星形胶质细胞自噬的异常目前尚不清楚,并且我们仍然缺少调节抑郁症发生发展中星形胶质细胞自噬功能的有效药物。氟西汀(Fluoxetine)是第一个被发现的选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI),临床上常用于治疗成人抑郁症、神经性暴食症和强迫症等神经精神疾患。氟西汀可以上调诸多脑区如前额皮层、海马和纹状体突触间隙的5-羟色胺浓度,改善患者情绪。此外,氟西汀具有抗炎,抗凋亡,抗肿瘤,神经保护等作用,在癌症,脑卒中等疾病中发挥重要作用。有研究报道氟西汀可以通过诱导自噬性细胞死亡对顽固性伯基特淋巴瘤发挥治疗作用,而氟西汀能否调节抑郁症中星形胶质细胞自噬功能尚不明确。本文通过建立慢性温和应激(Chronic mild stress, CMS)诱导的小鼠抑郁症模型,研究氟西汀对星形胶质细胞自噬功能的调节及其在星形胶质细胞存活中的作用。研究发现氟西汀可以显著改善CMS模型所致海马星形胶质细胞线粒体损伤并促进自噬小体的形成；培养原代海马星形胶质细胞,离体研究发现氟西汀可以通过促进线粒体自噬发挥对星形胶质细胞的保护作用；CMS模型小鼠海马立体定位注射自噬抑制剂3-MA可取消氟西汀对星形胶质细胞的保护作用,表现为GFAP阳性细胞数量减少,细胞突起数量减少。上述结果表明星形胶质细胞自噬异常与抑郁症的发生具有相关性,氟西汀通过促进自噬减少抑郁症发生发展中星形胶质细胞的死亡。本文的研究揭示了星形胶质细胞自噬在氟西汀神经保护和抗抑郁效应中的作用,进一步拓宽了对氟西汀治疗抑郁症分子机制的认识,也为研发新型抗抑郁药物提供了新的思路。目的：研究氟西汀对抑郁症模型小鼠海马星形胶质细胞自噬的调节,揭示其通过促进线粒体自噬发挥对星形胶质细胞的保护作用,阐明氟西汀抗抑郁作用的新机制。方法：1.本实验将雄性C57BL/6J小鼠(体重18-25g)随机分为4组：对照组、氟西汀单独给药组、抑郁症模型组和抑郁症模型+氟西汀治疗组,每组20只,每只单笼饲养,其中抑郁症模型组、抑郁症模型+氟西汀治疗组给予慢性温和应激(CMS),持续6周,此期间对照组、氟西汀单独给药组正常饲养；通过糖水偏爱实验检测模型成功后,氟西汀单给药组和抑郁症模型+氟西汀治疗组小鼠腹腔注射氟西汀(1Omg/kg/d, i.p.),同时对照组和抑郁症模型组小鼠每天注射等量的生理盐水,连续给药4周后,通过糖水偏爱实验、强迫游泳和悬尾实验评价氟西汀对抑郁症的治疗作用；2.电镜观察小鼠海马星形胶质细胞线粒体的损伤及自噬小体的形成；3.培养原代星形胶质细胞,Western blotting检测自噬的经典指标LC3和p62的表达,GFAP-LC3荧光双标方法观察氟西汀对星形胶质细胞自噬的调节；4.原代星形胶质细胞转染1nTag-Wasabi-LC3质粒,荧光显微镜下观察氟西汀对皮质酮模型下星形胶质细胞自噬的促进作用；5.原代星形胶质细胞转染GFP-LC3质粒,并使用MitoTracker deep red标记线粒体,同时分别使用MitoTracker Green 和 LysoTracker标记线粒体和溶酶体,观察氟西汀对原代星形胶质细胞线粒体自噬的作用；6.分别应用H2DCF-DA和MitoSOX荧光探针标记细胞内和线粒体ROS,观察给予氟西汀和皮质酮刺激后细胞内和线粒体ROS的生成,同时应用CCK-8试剂盒检测氟西汀和皮质酮刺激后的细胞活力；7.CMS模型小鼠腹腔注射氟西汀和自噬抑制剂3-MA并在处死前一周侧脑室注射3-MA(30μg),小鼠脑组织经多聚甲醛后固定、20%和30%蔗糖溶液梯度脱水后使用OCT胶包埋,Leica冰冻切片机制作25μm厚的海马脑区连续切片,免疫荧光统计海马星形胶质细胞数量和突起数量。结果：1.氟西汀改善CMS模型小鼠抑郁样行为小鼠造模5周后,糖水偏爱率及强迫游泳和悬尾不动时间相较于生理盐水组显著下降,氟西汀腹腔注射4周后,相较于CMS模型组小鼠糖水偏爱率升高11%,强迫游泳和悬尾不动时间分别缩短38%和34%,表明氟西汀可显著改善CMS模型小鼠的抑郁样行为。2.氟西汀改善CMS模型小鼠海马星形胶质细胞线粒体损伤并促进自噬小体的形成生理盐水组小鼠海马星形胶质细胞线粒体形态正常,无损伤情况；单独应用氟西汀组小鼠线粒体形态正常,并可观察到多个自噬小体；CMS模型组镜下可观察到大量损伤的线粒体,且并未观察到自噬小体的存在；氟西汀治疗组镜下线粒体形态正常,且可观察到自噬小体对损伤线粒体的吞噬,表明氟西汀可显著改善CMS模型小鼠海马星形胶质细胞线粒体损伤并促进自噬小体的形成。3.氟西汀促进星形胶质细胞自噬氟西汀0.1、1.0、10μM三个浓度分别处理24h后,10μM氟西汀显著上调LC3 Ⅱ/Ⅰ匕值(P<0.01),显著下调自噬底物p62的表达(P<0.01)；氟西汀(10μM)处理12、24h后均显著上调原代星形胶质细胞LC3 Ⅱ/Ⅰ比值,下调自噬底物p62的表达(P<0.01),其中24h时作用最显著(P<0.01),相比于对照组LC3Ⅱ/Ⅰ比值上调了76%,p62的表达下调72%,表明10μM氟西汀处理24h显著促进星形胶质细胞自噬。4.氟西汀促进皮质酮模型星形胶质细胞自噬小体和自噬溶酶体的形成使用GFAP和LC3抗体分别标记星形胶质细胞和自噬小体,10μM氟西汀处理24h后,胞内LC3 Ⅱ表达量显著多于对照组(P<0.01)；给予10μM皮质酮刺激后,LC3 II表达量显著减少(P<0.05),10μM氟西汀治疗后显著增加LC3 Ⅱ表达量(P<0.01),相较于皮质酮组,平均每个细胞中LC3 Ⅱ表达量增加了10倍。使用mTag-Wasabi-LC3红绿荧光质粒标记胞内L℃3蛋白,10μM氟西汀处理24h后,胞内自噬小体(黄色斑点)数量和自噬溶酶体(红色斑点)数量均显著增加(P<0.05);10μM皮质酮刺激后胞内自噬小体数量显著下调(P<0.01),10μM氟西汀治疗后自噬小体显著增加(P<0.01),自噬溶酶体数量亦显著上调(P<0.05),相比于皮质酮组,平均每个细胞中自噬小体和自噬溶酶体数量分别增加了18倍和15倍。表明氟西汀可促进星形胶质细胞自噬小体和自噬溶酶体的形成,保持自噬流的畅通。5.氟西汀促进皮质酮模型星形胶质细胞线粒体自噬 10μM皮质酮抑制星形胶质细胞自噬,其中自噬小体和线粒体的共定位显著减少(P<0.05),线粒体和溶酶体共定位显著减少(P<0.01),胞浆Parkin表达显著上调(P)<0.05),线粒体Parkin表达显著下调(P<0.05),线粒体外膜蛋白TOMM20表达显著上调(P<0.01)；10μM氟西汀治疗促进皮质酮模型星形胶质细胞线粒体自噬,其中自噬小体和线粒体共定位显著增加(P<0.05),线粒体和溶酶体共定位显著增加(P<0.01),相比于皮质酮组分别增加了63%和49%,Parkin向线粒体的转位显著增加(P<0.05),相较于皮质酮组增加了37%,10μM氟西汀处理后增强了对线粒体外膜蛋白TOMM20的泛素化降解作用(P<0.01),与皮质酮组相比,TOMM20蛋白表达减少了36%。表明氟西汀促进皮质酮模型星形胶质细胞Parkin的线粒体转位,启动线粒体自噬,增加对线粒体蛋白TOMM20的降解。6.氟西汀通过促进自噬发挥对原代海马星形胶质细胞的保护作用 应用H2DCF-DA荧光探针标记细胞内ROS, MitoSOX标记线粒体ROS,10μM皮质酮刺激24h后显著上调星形胶质细胞ROS和线粒体ROS水平(P<0.01),降低细胞活力(P<0.01)；氟西汀处理24h后胞内和线粒体ROS生成减少(P<0.05),细胞活力增强(P<0.05),与皮质酮组相比,线粒体ROS水平下降了25%,细胞活力上升了56%；给予自噬抑制剂3-MA(5mM)后,ROS释放增多(P<0.05),细胞活力降低(P<0.05),相较于氟西汀治疗组,线粒体ROS水平上升了22%,细胞活力下降30%。表明氟西汀通过促进自噬减少皮质酮模型星形胶质细胞线粒体ROS的释放,增强细胞活力,发挥对星形胶质细胞的保护作用。7.氟西汀通过促进自噬发挥对CMS模型小鼠海马星形胶质细胞的保护作用 氟西汀逆转CMS模型所致小鼠海马星形胶质细胞突起数量和GFAP阳性细胞数减少以及行为学不动时间的增加,与CMS组小鼠相比,海马星形胶质细胞突起数量增加了2倍,GFAP阳性细胞数增加了38%。注射自噬抑制剂3-MA后,氟西汀对星形胶质细胞的保护作用被取消,相比于氟西汀治疗组,海马星形胶质细胞突起数量显著减少(P<0.01),GFAP阳性细胞数减少(P<0.05)。表明氟西汀通过促进自噬增加CMS模型小鼠海马星形胶质细胞突起数量和SGZ区GFAP阳性细胞数,减轻星形胶质细胞的损伤,发挥对细胞的保护作用。结论：1.星形胶质细胞自噬异常与CMS所致小鼠抑郁症的发生具有相关性。2.氟西汀通过促进线粒体自噬减少抑郁症发生发展中星形胶质细胞的死亡和萎缩,发挥对星形胶质细胞的保护作用。本文工作的主要创新之处：1.揭示星形胶质细胞自噬在抑郁症病理过程中的重要角色,深化了对抑郁症发病机制的认识。2.阐明氟西汀通过调节线粒体自噬发挥对抑郁症模型小鼠星形胶质细胞的保护作用,为抗抑郁药物的研发提供了新的思路。