研究目的众所周知,细胞因子是免疫应答中的重要效应分子和调节分子,近年来的研究发现细胞因子在肿瘤的发生和发展中也发挥重要作用,已成为抗肿瘤的重要靶点。IL-37是2000年被发现的一个新的免疫负调控分子,属于IL-1家族。研究表明IL-37不仅可以表达在多种免疫细胞中,而且可以表达于多种实体组织器官的细胞中,包括肿瘤细胞。同时它也是罕见的既可以在细胞内也可以在细胞外发挥生物学作用的细胞因子之一。近年来有研究报道IL-37能够通过影响机体的免疫反应进而发挥抗肿瘤效应,例如在小鼠纤维肉瘤中,IL-37可以通过诱导IL-12依赖的适应性免疫反应抑制肿瘤的生长;在人肝细胞肝癌中,IL-37能够募集CD57+NK细胞从而抑制肿瘤的生长。然而,IL-37在肿瘤转移中的作用仍不清楚。除了通过影响机体的免疫反应参与肿瘤的发展以外,IL-37能否直接影响肿瘤的恶性行为以及确切的分子机制也有待进一步研究。为了明确IL-37在肿瘤发生发展中的直接作用并阐明其作用机制,为肿瘤治疗策略提供新思路,本文拟从以下几个方面进行研究:一、IL-37对肿瘤恶性行为影响的研究;二、IL-37抑制肿瘤恶性行为机制的研究。研究方法一、IL-37对肿瘤恶性行为影响的研究1.免疫组化方法检测肺腺癌及肝癌组织中IL-37的表达水平,并分析其与临床病例资料之间的关系。2.Western blot、免疫荧光和ELISA的方法检测IL-37在肿瘤细胞系中的表达。3.用IL-37 siRNA干扰肿瘤细胞系中IL-37的表达或用IL-37b质粒在肿瘤细胞系中过表达IL-37后,CCK8检测细胞增殖能力;Transwell检测细胞迁移能力。4.用对照或IL-37b慢病毒载体感染A549细胞,然后建立裸鼠皮下移植瘤模型。隔天测量肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线。最后将瘤体解剖、拍照并称重。免疫组化检测肿瘤中IL-37的表达。5.用对照或lL-37b慢病毒感染A549细胞,然后经尾静脉高压注射建立裸鼠转移瘤模型。观察小鼠生存状态,记录小鼠生存期并绘制小鼠的生存曲线。解剖小鼠,观察面部、四肢、脊柱、胸壁和肺等部位有无转移灶,将肺剖离,称重、拍照并计数表面转移灶数目。HE染色证实肺部转移灶。二、IL-37抑制肿瘤细胞恶性行为机制的研究1.用control siRNA和IL-37 siRNA及mock和IL-37b质粒转染肿瘤细胞系,然后用PAK-PBD pull down实验检测Racl的活性;用western blot的方法检测下游效应分子PAK的磷酸化作用的变化。2.用Racl的特异性抑制剂NSC23766预处理肿瘤细胞,然后用Transwell的方法对肿瘤细胞的迁移能力进行检测。用control siRNA和Rac1 siRNA转染肿瘤细胞,然后用western blot的方法检测Rac1的干扰效率。在沉默表达IL-37的同时加入Rac1特异性抑制剂NSC23766或同时干扰Rac1,用Transwell的方法对肿瘤细胞的迁移能力进行检测。3.用免疫荧光染色的方法观察IL-37和Rac1在肿瘤细胞中的定位关系。用免疫共沉淀的方法检测内源性IL-37能否和内源性Rac1结合。构建IL-37b前体、两种成熟体质粒以及Rac1野生型质粒,将IL-37b和Rac1质粒共转入293T细胞,通过免疫共沉淀实验检测外源性IL-37b的哪一存在形式能够与外源性Rac1发生结合。4.用免疫共沉淀和GST-pull down实验检测在细胞外IL-37重组蛋白和Rac1重组蛋白是否直接结合。5.构建Rac1的活化、失活形式的突变体以及截短突变体,将其和IL-37b△1-45质粒共转入293T细胞,免疫共沉淀检测两者是否结合。6.将Rac1和IL-37b△ 1-45或IL-37b△1-45空载体共转入293T细胞,或者在293T细胞中转入依次增多的IL-37bA 1-45质粒,分别提取膜蛋白和浆蛋白,western blot检测膜蛋白和浆蛋白中Rac1、Na,K-ATPase和actin的表达。如上述方法处理细胞后,用免疫荧光染色的方法观察Rac1在细胞膜及细胞浆中的表达变化。7.在293T细胞中转入依次增多的IL-37b△1-45质粒,western blot检测p-PAK和PAK的表达。将IL-37b△ 1-45质粒和对应空载体分别转入A549细胞,用western blot的方法检测p-PAK和PAK的表达;用免疫荧光染色的方法检测微丝的聚合作用。结果一、IL-37抑制肿瘤的恶性行为1.IL-37在肿瘤中低表达,并且与肿瘤转移及患者的不良预后显著相关(1)IL-37在肝癌组织中的表达降低首先,我们用免疫组织化学染色的方法检测了 20例临床患者肝癌组织中IL-37的表达。我们发现IL-37在肝癌组织中的表达是降低的,这和已有研究的结果是类似的。IL-37主要表达于正常的肝脏组织。尽管IL-37在不同肝癌患者癌组织中的表达水平不一,但是IL-37在邻近的非肿瘤炎症组织中的表达相对较高。并且已有研究报道IL-37的表达与肝癌的侵袭转移显著相关,IL-37的低表达提示病人预后较差。(2)IL-37在肺腺癌组织中的低表达与肿瘤转移相关,并且提示患者预后较差为了进一步证明IL-37在肿瘤中作用的临床意义,我们用免疫组化的方法检测了 IL-37在84例肺腺癌患者癌及癌旁组织中的表达。我们发现IL-37高表达于支气管上皮细胞中,而支气管上皮来源的肺腺癌组织中IL-37的表达是降低的。进一步分析IL-37的表达与患者临床病理资料之间的关系,发现IL-37的表达与肿瘤的淋巴结转移、病理分级、T分期及AJCC分期显著相关,并且肿瘤组织中IL-37表达较低的患者,其生存期较短。单因素Cox比例风险分析表明肿瘤组织中IL-37表达水平与肿瘤淋巴结转移、AJCC分期均是患者的预后因素。2.细胞内IL-37能有效抑制肿瘤细胞的生长和迁移(1)IL-37主要表达于肿瘤细胞的细胞浆,也可以被分泌到细胞外为了探究IL-37的生物学功能,我们首先检测了 IL-37在肿瘤细胞系中的表达。用western blot的方法发现多种肿瘤细胞系均可以表达IL-37。用免疫荧光的方法发现IL-37主要表达于细胞浆中。用ELISA的方法检测肿瘤细胞培养上清中IL-37的表达,结果发现肿瘤细胞中IL-37也可以被分泌到细胞外。(2)细胞内的IL-37抑制肿瘤细胞的生长为了研究IL-37对肿瘤细胞生长的影响,我们采用CCK8的方法检测细胞增殖能力,发现干扰IL-37后细胞增殖加快。向肿瘤培养上清中加入不同浓度的外源性IL-37重组蛋白后细胞增殖力能没有受到明显的影响,说明细胞内IL-37能够抑制肿瘤细胞的生长。(3)细胞内的IL-37抑制肿瘤细胞的迁移为了研究IL-37对肿瘤细胞迁移能力的影响,我们采用Transwell的方法,结果发现,过表达IL-37后细胞迁移能力明显降低,干扰IL-37后细胞迁移能力明显提高。以上结果表明IL-37能够抑制肿瘤细胞的迁移能力。为了探究IL-37的这一作用是通过细胞内途径还是细胞外途径实现的,我们向不表达IL-37的A549细胞培养上清中加入不同浓度的外源性重组蛋白,Transwell实验发现细胞迁移能力没有发生明显的变化,向表达IL-37的HepG2细胞的培养上清中加入IL-37中和抗体后,Transwell实验检测到细胞的迁移能力也没有明显变化。在A549细胞中过表达IL-37的同时用IL-37的中和抗体中和上清中的IL-37,IL-37对细胞迁移能力的抑制效应没有被减弱或逆转。以上结果表明是细胞内的IL-37抑制了肿瘤细胞的迁移能力。3.IL-37抑制体内肿瘤的生长和转移(1)IL-37抑制裸鼠皮下移植瘤的生长为了进一步证明IL-37抗肿瘤效应的生理意义,我们首先构建了裸鼠皮下移植瘤模型。免疫组化结果显示IL-37组肿瘤组织中成功高表达IL-37。与对照组相比,IL-37组肿瘤生长较慢,并且肿瘤体积和重量均较对照组低。以上结果表明IL-37可抑制裸鼠皮下移植瘤的生长。(2)IL-37抑制体内肿瘤的转移为了在体内证明IL-37对肿瘤转移的影响,我们构建了裸鼠转移瘤模型。结果显示IL-37组小鼠的生存率明显高于对照组,而且IL-37组肿瘤的远处转移(骨)率较对照组明显降低。剖离小鼠肺脏发现与对照组相比,IL-37组肺体积较小、重量较低。在解剖显微镜下计数肺表面合适大小的肿瘤结节发现IL-37组肺表面转移灶数目较对照组显著降低。肺脏切片HE染色进一步证实肉眼观察到的肺表面结节的确是肿瘤组织。以上结果表明IL-37能够在体内抑制肿瘤的转移。二、IL-37抑制肿瘤细胞恶性行为的分子机制1.IL-37抑制Rac1的活化上述结果表明IL-37能抑制肿瘤细胞的恶性行为,下一步我们要进一步探索其机制。运用PAK-PBDpulldown实验,我们发现沉默表达IL-37后增强了肿瘤细胞中Rac1的GTPase活性,而过表达IL-37则显著抑制了其活性。因为大量研究证明PAK是Rac1下游主要的效应分子,所以我们进而检测了 IL-37对PAK活化的影响。结果显示,干扰IL-37后显著增强了 PAK的磷酸化作用,而过表达IL-37明显减弱了 p-PAK的表达。这些结果表明IL-37抑制了 Rac1及其下游效应分子PAK的活化。2.IL-37以Rac1依赖的方式抑制肿瘤细胞的迁移为了进一步证实IL-37是否是通过Rac1信号通路抑制肿瘤细胞迁移,我们用Rac1特异性抑制剂NSC23766和Rac1的siRNA来抑制Rac1的活性或沉默其表达。结果表明Rac1抑制剂NSC23766明显减弱了细胞的迁移能力,并且在肿瘤细胞中50μM的NSC23766明显逆转了由于干扰IL-37引起的细胞迁移能力的变化。和这一结果一致,用siRNA沉默表达Rac1几乎完全消除了干扰IL-37对肿瘤细胞迁移的促进作用。这些结果证明IL-37通过抑制Rac1通路从而抑制肿瘤细胞迁移。3.成熟形式IL-37(氨基酸序列46-218)直接结合Rac1(1)IL-37和Rac1在细胞中共定位为了阐明IL-37和Rac1的确切关系,我们首先通过免疫荧光染色观察了两者在肿瘤细胞内的定位关系。我们发现两者存在明显的共定位,尤其是在细胞膜和细胞突起的边缘。为了证明这种现象是否具有普遍性,我们在急性白血病来源的单核细胞系THP-1中重复了相同的实验,得到了类似的结果。(2)内源性IL-37和内源性Rac1在细胞中相互结合为了证明内源性的IL-37是否和内源性的Rac1结合,我们在BEL-7402细胞中进行了免疫共沉淀(co-IP)实验,结果发现两者能够结合。另外,在THP-1细胞中也得到了相同的结果。(3)外源性成熟形式IL-37 IL-37b△1-45)与外源性Rac1在细胞中相互结合已有研究报道IL-37b N端第一和第二外显子是其前体结构域,能够被caspase 1和caspase4切割后形成两种成熟体,氨基酸序列分别是21-218和46-218。为了探究是IL-37前体还是两种成熟体与Rac1发生了结合,我们构建了 IL-37b前体(Flag-tagged IL-37b)和两种成熟形式的质粒:IL-37b△1-20 和 IL-37b△1-45。将 Myc-tagged Rac1 和 Flag-tagged IL-37b,IL-37b△1-20 或 IL-37b△ 1-45 质粒在293T细胞中共表达,然后通过co-IP实验检测两者的结合。我们发现只有IL-37b△1-45和Rac1结合而前体和IL-37b△1-20不结合。(4)成熟形式IL-37与Rac1可以直接相互结合我们进一步探究了 IL-37和Rac1之间的结合是否是直接的。在细胞外将纯化的成熟的人IL-37重组蛋白(氨基酸序列:46-218)和GST-Rac1重组蛋白混合,用co-IP和GST-pull down实验检测两者的结合。我们发现这两个蛋白可以直接结合。这些结果证明细胞内成熟形式的IL-37可通过直接结合Rac1来抑制其活性。4.成熟形式IL-37结合失活和活化形式Rac1的CAAX基序(1)成熟形式IL-37可以结合GDP-Rac1和GTP-Rac1因为Rac1有两种存在状态即失活形式(GDP-Rac1)和活化形式(GTP-Rac1),所以接下来我们想要证明成熟IL-37与Rac1之间的结合是否依赖于Rac1的活化状态。运用野生型Rac1,失活的Rac1(Rac1-17N)和活化的Rac1(Rac1-61L),通过co-IP实验我们证明了成熟IL-37和它们都可以结合,表明两者之间的结合不受Rac1活化状态的影响。(2)成熟形式IL-37结合Rac1的C-端高变区为了阐明Rac1的哪一结构域负责其与成熟IL-37的结合,我们构建了 Rac1全长(氨基酸序列1-192)和一系列截短体质粒:截短N-端1-47氨基酸(包含switch])、截短中间部分氨基酸124-135(包含insert region)、截短C-端高变区(氨基酸序列162-192)。通过co-IP实验,我们发现C-端高变区而不是switch I和insert region负责了成熟IL-37和Rac1的结合。(3)成熟形式IL-37结合Rac1 C-端高变区的CAAX基序已有研究报道高变区含有一段相邻的赖氨酸和精氨酸残基即PBR和一个CAAX基序。为了探究其中哪一个结构域参与了成熟IL-37的结合,我们构建了另外两种Rac1截短体,一种缺失PBR结构域,另一种缺失CAAX基序。通过co-IP实验,我们发现是CAAX基序而不是PBR在成熟IL-37和Rac1的结合中起到重要作用5.成熟形式IL-37抑制Rac1的膜转位Rac1的C-端高变区在Rac1靶向并锚定在细胞膜的过程中起到非常重要的作用,我们发现成熟IL-37结合于Rac1的C-末端,这提示它可能调节Rac1的膜转位。为了证明这一可能性,我们分别提取了细胞膜和细胞浆蛋白,用western blot的方法检测细胞膜和细胞浆中Rac1的表达变化,结果显示过表达成熟IL-37后显著抑制了 Rac1在细胞膜上的表达并且随着成熟IL-37表达增多Rac1在膜上的表达依次降低。免疫荧光显示293T细胞中Rac1主要定位于细胞膜,而过表达成熟IL-37后,Rac1在细胞膜上的表达明显降低,主要弥散表达于细胞浆。这些结果表明成熟形式IL-37抑制了 Rac1的膜转位。6.在Rac1信号通路中,IL-37bA1-45是发挥作用的一种成熟形式(1)成熟形式IL-37抑制Rac1下游主要效应分子PAK的磷酸化作用为了进一步研究在Rac1信号通路中成熟IL-37(氨基酸序列46-218)是否是发挥抑制效应的主要形式,我们检测了成熟IL-37(氨基酸序列46-2]8)对Rac1下游重要效应分子PAK磷酸化作用的影响。在293T细胞中,我们发现持续活化的Rac1的表达确实能诱导PAK的活化,表现为PAK的磷酸化作用增强。这种效应被成熟IL-37所抑制,并且呈剂量依赖性。在A549细胞中过表达成熟IL-37也可抑制PAK的磷酸化作用。(2)成熟形式IL-37抑制Rac1介导的微丝的聚合因为活化的Rac1能通过PAK依赖性或PAK非依赖性的途径诱导F-actin结构的组装,接下来我们检测了成熟IL-37对F-actin聚合作用的影响。我们发现与对照组相比,过表达成熟IL-37的A549细胞中F-actin的聚合率显著降低。以上结果表明成熟的IL-37能有效抑制Rac1的活化。结论1.IL-37在肿瘤组织中表达降低,其表达水平与肿瘤转移、患者预后密切相关。2.IL-37在体内和体外均可抑制肿瘤的生长和转移。3.IL-37抑制Rac1的活化。4.成熟形式IL-37直接结合Rac1 C-末端的CAAX基序。5.成熟形式IL-37抑制Rac1的膜转位进而抑制Rac1的活化,导致下游效应分子PAK的磷酸化作用及F-actin聚合作用降低。创新性和意义1.首次通过体内外实验证明细胞内成熟形式IL-37可抑制肿瘤转移,为以IL-37作为靶点设计肿瘤治疗药物提供理论依据和实验基础。2.首次提出成熟形式IL-37能够与Rac1直接结合并抑制其活性,即成熟形式IL-37是Rac1的内源性抑制分子,证实IL-37通过Rac1通路抑制肿瘤细胞的迁移,丰富了 IL-37的功能和分子机制研究。局限性1.提高临床标本数量,使得对IL-37表达与临床病理资料之间的相关性分析更加准确。2.我们将试图寻找能够区分不同亚型的检测方法,进一步明确不同亚型在肿瘤组织中的表达水平,这对于研究IL-37在肿瘤中的作用有重要意义。