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原发性肝细胞肝癌(hepatocelluar carcinoma，HCC)是常见的致死性恶性肿瘤之一，虽然各种治疗方法不断改进，但是该疾病的死亡率仍高居不下，究其原因主要是肝癌的复发及肝内外转移。所以针对肝癌转移机制的研究也成为目前的热点之一，也为肝癌的治疗提供了新的思路。肝癌细胞转移，最主要就是侵袭和迁移的过程，主要包括：肝癌细胞活动性增强，细胞之间粘附性降低，肝癌细胞从原发灶脱离后穿过细胞外基质及血管壁的基底膜，进入脉管循环，在这个过程中肝癌细胞还能促进血管的形成。而在这个过程中许多分子参与其中，如Fascin、E-cadherin、MMP-2、MMP-9及VEGF。Notch信号通路是一种经典的信号通路，该通路的家族成员在结构上具有高度的保守性。一般传统上认为Notch信号通路主要参与了生物个体的发育及组织的再生。随着对Notch信号通路的研究不断深入，发现该通路不仅参与了生物个体的发育过程，还参与肿瘤的不同发生、发展过程。目前国内外有关Notch信号通路在肝癌中的作用机制报道较少。尤其是关于其在肝癌转移中的作用及机制尚不清楚。本实验采用不同的肝癌细胞系，通过Notch信号通路的阻断剂来处理细胞，从细胞骨架改变、细胞迁移、细胞侵袭三个方面探讨了Notch信号通路参与肝癌细胞侵袭迁移的机制。结果提示Notch信号通路能够在上述三个方面，通过调控不同的分子发挥作用。本研究补充了Notch信号通路在肝癌中的作用机制，为阐明肝癌的转移机制奠定基础。实验一：Notch信号通路在肝癌细胞中的状态及阻断Notch信号通路对肝癌细胞侵袭迁移的影响。目的：探讨Notch信号通路在肝癌细胞中的状态及阻断Notch信号通路对肝癌细胞侵袭迁移的影响。方法：Transwell小室检测细胞的侵袭和迁移能力；RT-PCR的方法检测了Hes1、Hes5、Hey1的mRNA表达；Western Blot的方法检测了N1ICD的蛋白表达；MTT和细胞计数的方法检测了细胞的增殖；DAPT阻断Notch信号通路。结果：Hes1、Hes5、Hey1及N1ICD在肝癌细胞中高表达，与细胞的侵袭迁移能力呈正相关；1μmol/L和5μmol/L浓度的DAPT能够有效抑制Notch信号通路，并且不影响肝癌细胞的增殖，但能够抑制细胞的侵袭和迁移。结论：Notch信号通路在肝癌细胞系中成激活状态，并随着细胞侵袭迁移能力的增加而增加，阻断Notch信号通路后，肝癌细胞的侵袭迁移能力下调。实验二：阻断Notch信号通路改变肝癌细胞骨架的机制研究。目的：探讨Notch信号通路在调控肝癌细胞骨架中的作用机制。方法：免疫荧光和扫描电镜的方法检测了细胞的骨架和伪足变化；Western Blot的方法检测了Fascin的蛋白表达；采用DAPT阻断Notch信号通路。结果：1μmol/L和5μmol/L浓度的DAPT能够有效抑制肝癌细胞骨架和伪足的形成，并且抑制了Fascin的表达。结论：阻断Notch信号通路后，肝癌细胞的骨架结构发生改变，伪足减少，其机制可能是通过调控细胞骨架蛋白Fascin来发挥作用的。实验三：阻断Notch信号通路降低肝癌细胞迁移能力的机制研究。目的：探讨Notch信号通路在肝癌细胞迁移中的作用机制。方法：Transwell小室检测细胞的迁移能力；RT-PCR的方法检测了Snail和E-cadherin的mRNA表达；采用Western Blot的方法检测了Snail、E-cadherin及COX-2的蛋白表达；siRNA的方法干涉了Snail的表达；DAPT阻断Notch信号通路，NS-398阻断了COX-2；采用了PGE2模拟了COX-2的作用。结果：Snail和E-cadherin参与了肝癌细胞的迁移过程，并且Snail能够调节E-cadherin的表达。DAPT能够上调E-cadherin，下调Snail和COX-2。PGE2能够逆转DAPT对Snail/E-cadherin的调控作用；在肝癌细胞迁移过程中DAPT和NS-398起到了相同的作用，而PGE2能够逆转DAPT对肝癌细胞迁移的抑制作用。结论：Notch信号通路可能是通过调控COX-2/Snail/E-cadherin通路调控肝癌细胞的迁移过程。实验四：阻断Notch信号通路降低肝癌细胞侵袭能力的机制研究目的：探讨Notch信号通路在肝癌细胞侵袭中的作用机制。方法：Transwell小室检测了细胞的侵袭能力；Western Blot的方法检测了MMP2、MMP-9、VEGF、ERK1/2和磷酸化ERK1/2的蛋白表达；ELISA检测了MMP2、MMP-9、VEGF、ERK1/2和磷酸化ERK1/2的蛋白活力；siRNA的方法干涉了MMP2、MMP-9、VEGF的表达；DAPT阻断Notch信号通路，PD98059阻断了ERK1/2。结果：MMP2、MMP-9和VEGF参与了肝癌细胞的侵袭过程；DAPT能够下调MMP2、MMP-9、VEGF和磷酸化ERK1/2的表达和活力；在肝癌细胞侵袭过程中DAPT和PD98059起到了相同的作用。结论：Notch信号通路可能是通过调控ERK1/2/MMP2、MMP-9、VEGF通路调控肝癌细胞的侵袭过程。综上所述，本实验从多个方面证实了Notch信号通路在肝癌细胞侵袭转移中的作用，提示Notch信号可以通过多通路、多靶点参与肝癌细胞的侵袭转移过程。这一研究为揭示肝癌侵袭转移的机制奠定了理论基础，并为肝癌的临床治疗提供新的思路。