石油等化石资源可以用作燃料,同时也用作许多化工产品的原料。但是随着石油资源的消耗与随之而来的环境问题,寻找石油的替代品成为了一个热门的研究方向。合成生物学通过构建工程菌利用廉价的甘油等碳源实现化学品的生物合成,成为了一种新的生产化学品的方式。不饱和烯酸是一类重要的化学品,香豆酸、肉桂酸和粘糠酸是其中具有重要价值的组成部分。香豆酸和肉桂酸经过加氢还原得到的两种产物对羟基苯丙酸和苯丙酸也是重要的香料和药物前体。但是目前并没有生物合成这两种产物的报道。己二酸作为一种二元羧酸是生产尼龙的重要原料,目前工业上通过粘糠酸加氢生成己二酸。香豆酸、肉桂酸以及粘糠酸都具有α-β碳碳双键,为了获得这几种化学品加氢后的饱和有机酸,实验的关键步骤为筛选能够还原α-β碳碳双键的还原酶。烯醇还原酶可以对许多不饱和底物进行加氢还原,因此实验对多种不同来源的烯醇还原酶进行研究,通过体内酶活测试确定了来自丙酮丁醇梭菌的烯醇还原酶(CaER)能够完成香豆酸和肉桂酸的加氢还原。在有氧条件下,CaER对于香豆酸的初始酶活速度可以达到1.26 mmol/h/gDCW;对于肉桂酸的初始酶活速度可以达到3.18mmol/h/gDCW。确定了关键酶以后,通过添加实验对酪氨酸到对羟基苯丙酸、苯丙氨酸到苯丙酸的代谢途径进行了模块优化。将该烯醇还原酶与香豆酸、肉桂酸的合成途径结合起来,实现了对羟基苯丙酸和苯丙酸在大肠杆菌中的组成生物学合成。工程菌在72 h分别合成了225.10 mg/L对羟基苯丙酸和356.43 mg/L苯丙酸。CaER催化香豆酸和肉桂酸的体内加氢反应填补了生物合成对羟基苯丙酸和苯丙酸的空白。为了进一步利用烯醇还原酶实现产量的提升,以苯丙酸作为目标产物对CaER的表达条件进行了优化研究。CaER的催化反应需要NADH作为辅因子,为了使被氧化的NAD+重新还原成为NADH,甲酸脱氢酶被引入培养体系中。在辅酶再生系统存在下,苯丙酸的产量提高到394.74 mg/L。苯丙酸合成途径是需氧途径和厌氧途径的结合,为了平衡途径中各个模块的不同氧气需求,实验比较不同转速下的产量,确定200 rpm下苯丙酸的产量达到403.30 mg/L。采用共培养体系并引入可以促进细胞在低氧状态下对氧的吸收的血红蛋白,促进了苯丙酸产量的增加使苯丙酸的产量达到了507.16 mg/L。启动子的强弱对CaER的表达也有影响,将中强度tac启动子和高强度T7启动子与lac启动子进行比较,结果显示tac启动子调控下苯丙酸的产量达到了467.98 mg/L。实验证明CaER可以作用于香豆酸与肉桂酸,因此为了测试CaER对粘糠酸的催化能力,体内酶活测试选用了有氧和微好氧两种条件。在有氧条件下,添加粘糠酸并未检测到己二酸的生成。当培养条件改变为微好氧条件后,24 h可以检测到74.23 mg/L己二酸的生成。为了测试从水杨酸生产粘糠酸的反应效率,添加水杨酸进行生物转化实验,结果显示生成了28.70 mg/L己二酸。整合整条途径后实现了经由粘糠酸的己二酸的生物合成,获得了12.42 mg/L己二酸。共培养体系也用于增进己二酸的产量,实验结果表明共培养体系中积累了 18.29 mg/L己二酸。当进一步引入VHB后,共培养体系内积累了28.22 mg/L己二酸。本研究首次实现了对羟基苯丙酸与苯丙酸的组合生物学合成,并且建立了一条新的由CaER调控的己二酸合成途径,展示了合成生物学广泛适用的设计策略。