研究背景《肥胖相关性高血压管理的中国专家共识》指出,肥胖不但阻碍高血压患者控制血压,还可导致多种心血管危险因素聚集,从而加剧心血管损伤。中国已成为全球肥胖人口最多的国家,成年居民超重/肥胖率已超一半,超重/肥胖已成为我国人群高血压患病的重要驱动因素,肥胖者罹患高血压的风险增加3.5倍,且60-70%的成人高血压可直接归因于肥胖。我国成年高血压病患数为2.45亿,业已成为重大公共卫生问题。尽管减重治疗对部分肥胖相关性高血压患者有降压效果,但对已形成靶器官损害的肥胖相关性高血压疗效局限。目前常用的降血压西药,多需长期服药且患者依从性较差。鉴于肥胖相关性高血压的高发病率和死亡率,亟需探寻高效的治疗策略和药物。祖国医药在防治包括肥胖和高血压等慢病上颇具经验。尽管中医并无肥胖相关性高血压之病名,然据其病机,可归于“眩晕”、“头痛”、“中风”范畴。本病病机多属肝肾阴虚、湿痰浊瘀（脂）。因此,中医治疗肥胖相关性高血压,可采用补肝肾、祛湿化浊的治则。何首乌为传统补益药,可补肝肾、益精血。现代中医发现其化浊降脂之功效,用治高脂血症。现代药理研究则进一步揭示其对多种心脑血管疾病如心肌缺血/再灌注损伤、冠心病等具有保护作用。2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯2-O-β-D-葡萄糖苷（二苯乙烯苷,TSG）作为何首乌的主要活性成分,已被报道可改善血流量、降低炎症反应、促进血管生成等,然其对肥胖相关性高血压的作用机制尚不清楚。肥胖相关性高血压发病机制较为复杂。研究表明,脂肪因子从脂肪组织中分泌,参与调节与肥胖相关的多种代谢和生物学过程。网膜素-1（OMT-1）,也被称为内凝集素-1（Itln-1）,是一种脂肪因子。临床证据显示,肥胖和糖尿病患者血清OMT-1水平显著降低,低水平OMT-1还与冠心病、动脉粥样硬化等心血管疾病有关。然而,OMT-1在高血压、肥胖和内皮功能障碍中的具体作用和机制尚不清楚。研究目的本研究结合中医、西医对肥胖相关性高血压的认识,旨在探究1)何首乌能否改善肥胖相关性高血压和内皮功能障碍,并明确其改善肥胖相关性高血压和内皮功能障碍的功效成分;2)阐明何首乌改善肥胖相关高血压和保护内皮功能功效成分的作用机制。研究方法1.何首乌水提物主要化学成分含量测定:何首乌经水提得到何首乌水提物（PME）。建立HPLC方法,C18色谱柱分别考察线性关系、精密度、稳定性、重复性、加样回收率。将PME与混合对照溶液（TSG、大黄素、大黄素甲醚）所得图谱进行对照,根据峰面积计算PME中主要化学成分的平均含量。2.PME改善肥胖大鼠高血压及血管内皮功能的功效成分筛选:根据得到PME中化学成分的占比,分别等剂量灌胃ZDF肥胖大鼠PME（180 mg/kg）、TSG（100 mg/kg）、大黄素（3 mg/kg）、大黄素甲醚（1 mg/kg）和替米沙坦（20 mg/kg）,共14 d。无创血压计测量肥胖大鼠收缩压;分离大鼠肠系膜微动脉,取三级分支,检测乙酰胆碱（ACh）诱导的内皮依赖舒张功能或硝普钠（SNP）诱导非内皮依赖舒张效应,按血管舒张程度评定血管功能;收集血清,检测总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）浓度。此外,分别设置50/100/200mg/kg的TSG剂量组,以确定其给药和机制研究的较优剂量。3.TSG激活肥胖大鼠肠系膜微动脉Akt/e NOS/NO通路并减轻氧化/硝化应激水平:灌胃ZDF肥胖大鼠和对照大鼠TSG（100 mg/kg）,连续14 d。测量其收缩压,分离其肠系膜微动脉三级分支评定微血管舒缩功能。免疫印迹检测大鼠肠系膜微动脉（p-）Akt、（p-）e NOS、NOX-2、p22phox的表达,DAF-FM DA荧光探针检测大鼠肠系膜微动脉NO生成,二氢乙锭（DHE）荧光探针检测O2·-,二氢罗丹明123（DHR123）荧光探针检测ONOO-浓度。4.TSG通过上调OMT-1水平延缓肥胖相关性高血压的发生:采用ELISA法检测12例超重/肥胖者和12例正常体重者血清OMT-1、TG浓度,彩色多普勒超声检测受试者肱动脉血管内皮功能（FMD）,对所得结果进行相关性分析,得出肥胖患者OMT-1与肱动脉内皮功能相关性。然后检测肥胖大鼠网膜脂肪和血清中OMT-1浓度。进一步,棕榈酸钠模拟肥胖状态,培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）24 h,后给予TSG（100μM）处理。人前脂肪细胞（HPA-v）加入成脂诱导分化培养基,油红O染色确定诱导分化成功后,成熟脂肪细胞给予TSG处理。成熟脂肪细胞和HUVECs在6孔板Transwell小室行共培养。上室培养成熟脂肪细胞,下室接种HUVECs,培养48 h,免疫印迹检测（p-）Akt、（p-）e NOS、NOX-2、p22phox的表达,荧光探针检测NO、O2·-、ONOO-浓度。然后,CRISPR/Cas9技术构建网膜素基因敲除OMT-/-小鼠,敲除区域设计在小鼠Itln-1基因外显子3-7。OMT-/-小鼠给予TSG（100 mg/kg）灌胃14 d。测量其收缩压,分离其主动脉评定血管舒缩功能。免疫印迹检测主动脉（p-）Akt、（p-）e NOS、NOX-2的表达,荧光探针检测小鼠主动脉NO、O2·-、ONOO-浓度。5.TSG通过增加肥胖大鼠脂肪组织中PPAR-γ上调OMT-1表达:OMT-/-小鼠网膜脂肪组织抽提总RNA,质检合格后Illumina Hi Seq 2500平台行高通量测序并进行全转录组芯片信息分析。Ch IP-IT高灵敏度试剂盒对成熟脂肪细胞进行Ch IP检测。input分别加入Ig G抗体、H3抗体、PPAR-γ抗体和混匀的磁珠,进行共沉淀并实施定量PCR检测。共培养细胞体系转染Itln-1 si RNA、或给予TSG（100μM）、PPAR-γ抑制剂T0070907（10μM）处理,PCR和免疫印迹检测脂肪细胞中PPAR-γ和OMT-1表达,免疫印迹检测HUVECs中（p-）Akt、（p-）e NOS、NOX-2的表达,荧光探针检测NO、O2·-、ONOO-浓度。此外,检测肥胖大鼠和OMT-/-小鼠脂肪组织中PPAR-γ表达。研究结果1.PME和等剂量TSG可显著改善肥胖相关性高血压和内皮功能障碍1)PME中3种主要化学成分的HPLC含量测定:根据建立的HPLC方法,分别得到TSG标准曲线:y=24206x-20.34 r2=0.99996,大黄素标准曲线:y=26273x+0.665r2=0.99998,大黄素甲醚标准曲线:y=26445x-0.547 r2=1;精密度RSD分别为0.11%、0.37%、0.36%;稳定性RSD分别为0.29%、1.35%、0.88%;重复性RSD分别为2.73%、2.00%、2.18%;加样回收率分别为112.08%、100.47%、92.86%,其RSD分别为3.676%、3.275%、0.671%。表明该方法性能良好。根据峰面积计算得PME中3种主要化学成分平均含量为:TSG 563.75 mg/g、大黄素15.89 mg/g,大黄素甲醚5.26 mg/g。2)TSG是PME改善肥胖相关性高血压和内皮功能障碍的功效成分:与对照大鼠相比,肥胖大鼠体重增加,SBP升高,血清TG、TC、LDL-C浓度上调,HDL-C浓度下调,糖耐量功能显著受损,且肠系膜微动脉对ACh诱导内皮依赖性舒张反应下降。分别给予灌胃PME（180 mg/kg）和TSG（100 mg/kg）治疗14 d,可显著降低肥胖大鼠体重、SBP、血脂水平,改善肠系膜微动脉内皮舒张程度,但未改善其糖耐量功能,且PME与等剂量TSG治疗作用无显著差异。而等剂量大黄素（3 mg/kg）和大黄素甲醚（1 mg/kg）则不能有效改善上述指标。设置TSG（50/100/200 mg/kg）剂量组,发现TSG 100 mg/kg组与TSG 200 mg/kg组均可显著降低肥胖大鼠体重、SBP、血脂水平,并改善肠系膜微动脉内皮舒张,表明TSG是PME的主要有效成分即功效成分,可改善肥胖大鼠肠系膜微动脉内皮功能并降低其收缩压。2.TSG通过上调肥胖大鼠OMT-1表达、激活微动脉Akt/e NOS/NO通路并减轻氧化/硝化应激发挥降低肥胖相关性高血压功效1)TSG激活肥胖大鼠微动脉Akt/e NOS/NO通路并减轻氧化/硝化应激水平:血管张力实验显示,e NOS抑制剂L-NAME预孵育可显著抑制TSG对肥胖大鼠微动脉内皮功能的改善作用,提示TSG上述作用可能与e NOS信号有关。免疫印迹结果显示,TSG可激活肥胖大鼠肠系膜微动脉Akt/e NOS磷酸化,并降低p22phox、NOX-2的蛋白表达,此外,TSG可提高NO生物利用度、降低O2·-和ONOO-水平。2)TSG通过上调肥胖大鼠OMT-1水平改善肥胖大鼠微动脉内皮功能和高血压:临床观察中发现,与体重正常患者相比,超重/肥胖患者血清OMT-1显著降低,且随着BMI增加FMD显著减弱;相关性分析显示,血清OMT-1水平与FMD呈显著正相关。此外,与对照大鼠相比,肥胖大鼠脂肪组织和血清OMT-1水平降低,TSG治疗显著上调OMT-1水平;TSG（100μM,24 h）上调成熟脂肪细胞中OMT-1表达。rh OMT显著改善肥胖大鼠受损的肠系膜微动脉内皮功能,其作用被L-NAME预孵育阻断。进一步,rh OMT（300 ng/m L,1 h）可显著激活HUVECs Akt/e NOS磷酸化,并下调p22phox、NOX-2蛋白表达,增加NO生成、降低O2·-和ONOO-水平。在HUVECs与成熟脂肪细胞共培养体系中靶向Itln-1 si RNA,发现TSG上调脂肪细胞OMT-1表达作用被Itln-1 si RNA阻断,且TSG激活HUVECs Akt/e NOS/NO、减轻氧化/硝化应激水平的作用同样被阻断。OMT-/-小鼠体重增加,SBP升高,内皮依赖性血管舒张功能下降,血管Akt/e NOS磷酸化减弱,NO生物利用度降低,氧化/硝化应激增加,TSG未能改善上述现象。3)TSG通过激活肥胖大鼠脂肪中PPAR-γ上调其OMT-1水平:转录组学结果显示OMT-/-小鼠网膜脂肪组织中PPAR-γ水平明显降低。Ch IP-q PCR结果表明,脂肪细胞中转录因子PPAR-γ可与Itln-1基因启动子结合,TSG或罗格列酮处理可分别显著促进该结合,最终导致脂肪细胞中OMT-1 m RNA和蛋白表达上调。在共培养细胞体系中,TSG上调脂肪细胞PPAR-γ和OMT-1表达,激活HUVECs Akt/e NOS/NO信号、减轻氧化/硝化应激,该作用被PPAR-γ抑制剂T0070907所阻断。然而,Itln-1 si RNA或OMT-/-不能阻断TSG上调PPAR-γ表达作用。研究结论1.建立同时测定PME中TSG、大黄素和大黄素甲醚3种主要化学成分含量的HPLC方法;根据测得在PME中的含量占比,经等剂量药效学筛选后发现,PME和与之等剂量TSG可显著降低肥胖大鼠的高血压,改善微血管内皮功能障碍;由此说明,TSG是PME保护血管内皮、延缓肥胖相关血压升高进程的关键功效成分。2.首次发现脂肪细胞核因子PPAR-γ表达减少可致OMT-1下调,进而促发肥胖相关高血压和血管内皮功能障碍,其机制与诱导血管硝化/氧化应激增强有关;何首乌中TSG可通过促进肥胖大鼠脂肪中PPAR-γ与Itln-1基因启动子结合,增加OMT-1表达水平,进而激活肥胖大鼠微血管内皮Akt/e NOS/NO信号,减轻氧化/硝酸应激水平,改善内皮功能障碍,延缓肥胖相关性高血压的发生。