Sema4D是轴突导向分子Semaphorin家族成员,又被称为CD100,其作用除了调节神经轴突导向、血管新生、肿瘤转移外,在免疫系统中也发挥了重要作用。Sema4D是一个分子量150kD的跨膜蛋白,在免疫细胞和血小板中表达,目前对Sema4D的研究主要集中在其生理作用,其在病理过程中的作用和机制越来越受到重视。我们实验室的前期结果表明Sema4D在血栓形成和心肌缺血再灌注损伤中发挥重要作用,我们拟对其在其他心血管疾病如心衰和肥胖相关疾病中的作用进行进一步研究。目的:1研究Sema4D在心衰病人血浆中的水平和来源心力衰竭是各种严重心脏疾病的共同通路,死亡率与恶性肿瘤相仿,目前对于心力衰竭的治疗方法非常有限,同时也需要一些简便易行的诊断方法。免疫反应在心力衰竭的发生发展中发挥重要作用,有些炎症因子可以作为心衰的诊断指标,如肿瘤坏死因子(TNF)等。Sema4D是表达在T细胞、血小板等表面的跨膜蛋白,具有活化T细胞和血小板的功能,在活化过程中可以被切割释放出有活性的可溶性片段。因此我们推测Sema4D可能会参与心力衰竭过程,并且可以作为生物标志物用于心力衰竭的诊断,为了证明这一假设,我们将利用临床样本,(1)测定心衰病人血浆中可溶性Sema4D的水平;(2)研究Sema4D表达水平与心衰患者疾病严重程度的关系,探讨其在心衰患者的诊断和疾病程度评估中的意义;(3)并初步探讨心衰患者血浆Sema4D高表达的细胞机制。2研究Sema4D在肥胖和脂肪肝中的作用和机制肥胖是2型糖尿病和许多心血管疾病的主要风险因素,而脂肪组织的长期慢性炎症反应是肥胖诱导相关疾病的重要原因。由于Sema4D在免疫细胞中的作用,我们推测Sema4D可能会通过活化T细胞等促进脂肪炎症;同时由于Sema4D可以通过其受体PlexinB1调节Rho的活性,而Rho通路对于脂肪分化有重要调节作用,Sema4D也可能通过PlexinB1影响脂肪分化,参与肥胖相关疾病。为了证明我们的假说,我们利用基因工程小鼠以及高脂饲料诱导的肥胖和脂肪肝模型,(1)研究sema4d及其受体plexinb1在高脂饮食诱导的肥胖和脂肪肝中的作用;(2)初步探究sema4d和plexinb1调节高脂饮食诱导的肥胖和脂肪肝的分子机制。方法:1建立可溶性sema4d的elisa检测方法,检测正常人和心衰病人外周血中sema4d的水平⑴可溶性sema4d的elisa检测方法的建立扩增含有his标签标记的sema4d的细胞外段的psectag2b质粒,通过脂质体转染至293t细胞,收集细胞培养上清,利用亲和层析法分离纯化上清中的sema4d蛋白,作为标准品。以可溶性sema4d蛋白作为抗原免疫小鼠,制备10株单克隆抗体,从中筛选两株分别作为包被抗体和检测抗体,检测抗体标记hrp。绘制标准曲线,建立夹心elisa方法。⑵正常人和心衰病人外周血中sema4d水平检测收集126位正常人的edta抗凝外周血,离心取血浆。elisa方法测定血浆中可溶性sema4d的水平,分析不同性别和年龄的正常人外周血中sema4d的差异。通过流式细胞术和westernblot分析17β雌二醇对jurkat细胞和血小板表面sema4d表达的影响。收集157例心衰病人的edta抗凝外周血,离心取血浆,统计这些病人的基本资料包括年龄、性别、并发症等。用建立的elisa方法检测病人血浆中sema4d的表达,比较心衰病人和正常人血浆sema4d水平及其与年龄和性别的关系,并分析不同并发症如糖尿病或者高血压对心衰病人血浆中sema4d表达的影响。2心衰病人外周血t细胞、b细胞、血小板表面sema4d的表达。(1)通过ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心分离心衰病人(hf)和正常人(hd)外周血淋巴细胞,分别用cd3和cd19的抗体标记t细胞和b细胞,同时孵育sema4d抗体,流式分析t细胞和b细胞表面sema4d的表达情况。(2)流式检测心衰病人和正常人外周血中cd4+t细胞和cd8+t细胞表面sema4d的表达。(3)通过同时孵育sema4d和cd41抗体,流式检测正常人和心衰病人血小板表面sema4d的表达。3检测sema4d敲除对高脂诱导的肥胖和脂肪肝的影响(1)收集2型糖尿病病人和正常对照的外周血浆,elisa方法检测血浆中可溶性sema4d的表达水平;取正常饮食(chowdiet)和高脂饮食(hfd)的小鼠,取内脏脂肪组织提取rna,逆转录成cdna,实时定量pcr检测sema4d及其受体plexinb1、plexinb2和cd72的表达。(2)每5-7天称量高脂饮食喂养(8-10周)的wt和sema4d-/-小鼠体重,观测小鼠的体重变化,同时检测高脂饮食喂养小鼠的脂肪含量以及血脂变化,以及葡萄糖耐受性。(3)取分别高脂喂养8周和16周的wt和sema4d-/-小鼠肝脏,称量,肝脏冷冻包埋盒石蜡包埋后切片,分别油红o染色和he染色,显微镜下观察和拍照,分析脂肪肝的严重程度。(4)取高脂饮食喂养8-10周的wt和sema4d-/-小鼠,分离生殖器脂肪组织细胞后,流式细胞分析两组小鼠脂肪组织中炎症细胞的浸润,包括cd45+细胞、cd4+t细胞、cd8+t细胞、f4/80+巨噬细胞、cd11+m1型巨噬细胞的数量和比例的变化。4体外观察sema4d对脂肪分化的影响取6-8周小鼠,分离脂肪组织,胶原酶消化后离心去除上层脂肪细胞,下层基质细胞培养3代后,流式检测间充质干细胞特异性表面标志物的表达,并转染对照和表达sema4d细胞外段的质粒,加入脂肪分化诱导剂,分化7天后油红o染色观察sema4d对脂肪分化的影响。5研究plexinb1敲除对高脂诱导的肥胖和脂肪肝的影响取wt和plexinb1-/-小鼠高脂饮食喂养8-10周,观察小鼠的体重变化,脂肪含量,肝脏冷冻包埋后油红o染色观察脂肪肝的严重程度。结果:1测定并分析正常人和心衰病人外周血中sema4d的含量(1)可溶性sema4d含量检测的elisa方法的建立为了测定心衰病人sema4d的表达,我们首先建立了夹心elisa方法。我们首先扩增了含有his标签标记的sema4d的胞外段psectag2b质粒,通过脂质体转染罚转染至293t细胞,用亲和层析法分离纯化上清中的sema4d蛋白,sds-page电泳结果显示其分子量在120kd作用,该蛋白作为标准品。并以该蛋白作为抗原免疫小鼠,制备了10株单克隆抗体,从这10株单克隆抗体中筛选了两株分别作为包被抗体和检测抗体,检测抗体标记hrp。并以该蛋白作为抗原免疫小鼠,制备了10株单克隆抗体,从中筛选两株分别作为包被抗体和检测抗体,检测抗体标记hrp,建立夹心elisa方法。绘制标准曲线,建立夹心elisa方法,并得到了很好的标准曲线(r2=0.996)。(2)心衰病人特别是合并糖尿病的心衰病人血浆中sema4d水平显著增我们收集了126位正常人的edta抗凝外周血,离心取血浆。通过elisa方法测定可溶性sema4d的表达。结果显示,不同年龄组sema4d表达没有显著差异,但正常男性(5.15±3.30ng/ml,n=63)较正常女性(4.19±2.39ng/ml,n=63,p<0.05)sema4d表达显著增加。此外,17β雌二醇能够显著抑制jurkat细胞表面sema4d的表达(p<0.05),也能够抑制collagen诱导的血小板sema4d切割。心衰病人外周血sema4d表达水平(8.94±5.89ng/ml)显著高于正常对照(4.67±2.99ng/ml)(p<0.0001)。但不同心衰分级、年龄对sema4d的表达没有影响。男性心衰病人(9.26±6.35ng/ml,n=88)较女性心衰病人(8.54±5.26ng/ml,n=69)有增加的趋势,但无显著差异(p=0.19)。合并糖尿病(w/dm)的心衰病人(10.45±5.76ng/ml,n=40)较未合并糖尿病的心衰病人(w/odm)(8.42±5.87ng/ml,n=117)sema4d表达显著增加。而是否合并高血压(hp)对sema4d的表达无显著影响。2心衰病人外周血t细胞和血小板表面sema4d表达水平变化。(1)心衰病人cd3+t细胞(p=0.002),包括cd4+t细胞(p=0.006)和cd8+t细胞(p=0.015)表面sema4d水平显著升高,提示t细胞可能是心衰病人血浆中sema4d增加的一个重要来源。(2)心衰病人b细胞表面sema4d表达水平没有变化(p=0.46),血小板表面sema4d虽然有增加的趋势,但无显著差异(p=0.188)。3sema4d敲除促进高脂饮食诱导的小鼠肥胖和脂肪肝。(1)糖尿病病人血浆中和高脂饮食的小鼠脂肪组织中sema4d表达增加。elisa检测结果表明2型糖尿病病人较正常对照外周血中可溶性sema4d的表达水平显著增加,此外喂食高脂饲料的小鼠脂肪组织中sema4d表达水平显著增加(p<0.05),而sema4d受体plexinb1(p<0.05)和plexinb2(p<0.05)表达则显著下降,cd72表达无明显变化。(2)sema4d敲除促进高脂饮食诱导的小鼠肥胖及胰岛素抵抗。sema4d在高脂饮食小鼠脂肪组织中表达上调提示sema4d可能参与调节肥胖过程,为了证实这一假说,我们通过高脂饮食喂养的wt和sema4d-/-小鼠8-10周,持续监测其体重变化,结果显示雄性和雌性sema4d-/-小鼠分别较wt雄、雌小鼠体重均有显著增加,sema4d-/-小鼠与wt相比的生殖器脂肪(genitalfat)(p<0.01)和肾周脂肪(perirenalfat)(p<0.01)占体重的百分比显著增加。血脂检测表明sema4d-/-小鼠空腹三脂酰甘油(tg)、tc、ldl-c较wt显著增加,而hdl-c表达无明显变化.此外,sema4d敲除显著降低高脂饮食诱导的小鼠葡萄糖耐受性(p<0.05)。(3)sema4d敲除促进高脂饮食诱导的脂肪肝。称量高脂饮食16周后wt和sema4d-/-小鼠的肝脏和脾脏重量,结果显示sema4d-/-小鼠较wt小鼠肝脏(p<0.0001)和脾脏(p<0.01)重量均有显著增加。为了验证sema4d对脂肪肝的作用,我们分别取高脂饮食8周和16周的wt和sema4d-/-小鼠的肝脏固定后石蜡包埋,组织切片,he染色分析各组小鼠的脂肪肝严重程度。结果显示sema4d-/-组小鼠脂肪肝较wt小鼠更加严重。(4)sema4d敲除对高脂饮食条件下小鼠脂肪组织中炎症细胞浸润的影响。流式细胞仪检测高脂饮食条件下wt和sema4d-/-小鼠内脏脂肪组织中炎症细胞的数量和比例。结果显示sema4d-/-较wt小鼠生殖器脂肪组织中cd45+白细胞(p=0.0009)、cd4+t细胞(p=0.02)、cd8+t(p=0.002)细胞和f4/80+巨噬细胞(p=0.02)的数量显著增加。随后我们分析不同炎症细胞在脂肪组织的百分比,我们发现cd45+白细胞占所有细胞的百分比,以及cd4+t细胞、cd8+t细胞占cd45+白细胞的百分比均没有显著变化,cd45+白细胞占所有细胞的百分比有增加的趋势,但无统计学意义(p=0.15)。cd4+t细胞(p=0.29)、cd8+t(p=0.09)细胞百分比也无明显变化,这可能与sema4d有活化t细胞的作用有关。但是,f4/80+巨噬细胞(p=0.0005)、cd11+m1型巨噬细胞(p=0.02)占cd45+白细胞的百分比显著增加。4sema4d体外抑制脂肪分化从脂肪组织中分离间充质干细胞,传到第三代后,流式细胞分析仪检测间充质干细胞marker(cd90和cd105)的表达。结果显示分离的间充质干细胞不表达白细胞的markercd45,提示干细胞中没有白细胞的污染,并且绝大多数细胞表达间充质干细胞的markercd90和cd105;随后,我们将脂肪间充质干细胞接种于六孔板,分别转染对照和表达sema4d细胞外段的质粒,待细胞长满后加入脂肪分化诱导培养基,第七天取细胞进行油红o染色,检测脂肪分化效率。结果显示转染了sema4d的细胞脂肪分化明显降低。5plexinb1敲除促进高脂诱导的脂肪肝。rt-pcr检测plexinb1在骨骼肌、内脏脂肪、肝脏中的表达,已知表达plexinb1的肾脏作为阳性对照,结果显示内脏脂肪和肝脏均表达plexinb1,但肝脏中plexinb1表达量较高,高脂饮食诱导后小鼠肝脏中plexinb1表达量明显下降(p<0.01)。剥离高脂饮食喂养wt和plexinb1-/-小鼠的生殖器脂肪和肾周脂肪,并拍照。与sema4d-/-类似,plexinb1敲除也促进高脂饮食诱导的肥胖。同样,油红o染色结果显示plexinb1-/-小鼠脂肪肝显著增加,realtime-pcr结果发现脂代谢相关基因ppar?1和ppar?2的表达也显著上调。结论:1.心衰病人特别是合并糖尿病的心衰病人外周血中可溶性sema4d水平较正常人显著增加,提示sema4d可能成为心衰病人生物标志之一。2.心衰病人血浆中可溶性sema4d含量增加与t细胞包括cd4+t细胞和cd8+t表面sema4d表达水平上调有关。3.sema4d敲除促进高脂饮食诱导的肥胖和脂肪肝。4.sema4对高脂饮食诱导的肥胖和脂肪肝的作用可能是通过其受体plexinb1介导的。5.Sema4D体外抑制间充质干细胞向脂肪的分化,可能参与高脂饮食诱导的肥胖过程。