研究背景多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是育龄妇女常见的内分泌激素代谢紊乱性疾病,亦是引起不孕的最常见原因。至今为止PCOS的病因及发病机制尚不清楚,目前的研究主要集中在遗传相关基因因素、环境因素及卵巢局部分子生物学改变因素等方面。越来越多的证据表明,PCOS患者异常的卵泡发育过程导致了卵子发育潜能低下。我们的临床实践发现卵泡期超长方案促排卵的PCOS患者能够获得较高的卵子成熟率及优质胚胎率,推测超长降调后可能通过调控某种信号通路促进了卵子成熟以及后续IVF结局的改善。卵丘颗粒细胞(cumulus granulosacells)紧紧围绕在卵母细胞的周围,通过与卵母细胞周围的缝隙连接为卵母细胞提供能量,对卵母细胞的发育成熟具有十分重要的调控作用。Wnt基因所编码的蛋白是一类分泌型糖蛋白,它可以通过自分泌或者旁分泌作用,激活细胞内信号通路调节靶基因的表达,调控细胞的增殖、分化、迁移、极性化以及凋亡。经典Wnt信号途径在不同物种中该通路的分子机制具有极高的保守性,其分子机制为:Wnt/β-catenin信号分子的受体是卷曲蛋白(Frizzled),而低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(LRP5/6)则是其辅助受体,β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路的下游枢纽信号分子。当Wnt信号通路特异性抑制物出现在细胞外时,Wnt蛋白与其受体的结合将会受到抑制,细胞质中的β-catenin随即与由轴蛋白(Axin)、糖原合成酶-3β(GSK-3β)和结肠腺癌息肉蛋白(APC)三者共同形成的降解复合物结合,与此同时,β-catenin被该降解复合物上的GSK-3β磷酸化,磷酸化后的β-catenin被蛋白酶体降解,最终导致细胞质中的β-catenin水平显著降低。当细胞外不存在Wnt信号通路抑制物时,Wnt蛋白可与细胞膜上的Frizzled和LRP5/6受体结合,进而通过两条途径抑制胞质内的β-catenin降解,最终β-catenin达到一定量时,可向细胞核内移位,并与细胞核内的转录因子 TCF/LEF(T-cell factor/lymphocyte enhancer binding factor)家族及其它转录共激活因子结合形成转录激活复合体,该复合体作为转录激活因子可引起Wnt/β-catenin信号通路的靶基因表达,从而发挥调控作用。黄鑫等人分离到PCOS患者卵丘颗粒细胞中的差异表达基因,pathway分析发现部分上调表达基因(WNT8A;SOX17;FZD3;CHP2)是Wnt/β-catenin信号通路的成员基因,这说明Wnt/β-catenin信号通路可能参与了 PCOS患者卵子发育的调控。因此,为了探讨Wnt/β-catenin信号通路在卵泡期超长方案促排卵的PCOS患者卵子成熟中的调控机理,我们的研究设计分成以下三部分:第一部分 PCOS患者IVF促排卵方案的新选择-卵泡期超长降调节促排卵方案目的:评价3种IVF促排卵方案治疗多囊卵巢综合征(PCOS)患者的疗效,从而分析优先选择的IVF促排卵方案。方法:将408例PCOS患者(464个治疗周期)分为3组:IVF1组(口服避孕药长方案,n=91)、IVF2组(GnRH拮抗剂方案,n=80)、IVF3组(卵泡期超长方案,n=293),统计分析IVF结局。结果:卵泡期超长方案组获卵数,卵子成熟率,优质胚胎率明显高于其他2组,组间差异有显著性;新鲜胚胎移植后卵泡期超长方案组妊娠率明显高于其他组,组间有差异;3组的受精率,卵裂率均无明显差异。结论:本研究表明卵泡期超长降调方案治疗过程简便、卵子成熟率、优质胚胎率及妊娠率高,是PCOS患者体外受精促排卵方案的良好选择。第二部分:Wnt/β-catenin信号通路在PCOS患者卵子成熟过程中的调控(一)小鼠卵泡发育中的Wnt/β-catenin信号传导方法:1.正常33日龄性成熟FVB和ICR雌小鼠经颈椎脱臼法处死;2.取左右卵巢,剃掉卵巢表面多余脂肪后,放入含有PBS的1.5ml EP管中;3.提取组织蛋白;4.免疫组化法检测Wnt信号通路蛋白LRP5/6、GSK3α,β、DVI3、TCF-4蛋白在小鼠卵巢组织中的定位;5.WesternBlot 法检测 Wnt 信号通路蛋白 LRP5/6、GSK3α,β、DVI3、TCF-4 蛋白在小鼠卵巢组织中的表达水平。结果:1.免疫组化法检测Wnt信号通路蛋白在小鼠卵巢组织中的定位。(1).免疫组化法检测LRP5/6、GSK3α,β蛋白在小鼠卵巢组织中的定位,结果显示:LRP5/6蛋白在小鼠的卵巢组织细胞膜上高表达,GSK3α,β蛋白在小鼠的卵巢组织细胞的胞浆中表达。(2).免疫组化法检测TCF-4,DVI3蛋白在小鼠卵巢组织中的定位,结果显示:DVI3蛋白在细胞内膜上高表达,TCF-4蛋白在细胞核中高表达。2.Western Blot法检测 Wnt信号通路蛋白在小鼠卵巢组织中的表达。(1).WB法检测小鼠卵巢组织DVI3蛋白,结果显示:DVI3蛋白在FVB小鼠卵巢组织中高表达,但在ICR小鼠卵巢组织中表达较低。(2).WB法检测小鼠卵巢组织LRP5/6蛋白,结果显示:在小鼠的卵巢组织中未检测到LRP5/6表达,且磷酸化LRP5/6后结果不明显。(3).WB法检测小鼠卵巢组织TCF-4蛋白,结果显示:TCF-4蛋白在FVB小鼠卵巢组织中高表达,但在ICR小鼠卵巢细胞中表达较低。结论:1.IHC结果表明LRP5/6蛋白在小鼠的卵巢组织细胞外膜上高表达,DVI3蛋白在细胞内膜上高表达,GSK3α,β蛋白在细胞浆中表达,TCF-4蛋白在细胞核中高表达。2.WB法检测细胞膜上受体LRP5/6蛋白在小鼠的卵巢组织中未见表达,磷酸化结果不明显,需要更换抗体进一步实验。WB结果显示TCF-4,DVI3蛋白在FVB小鼠卵巢组织细胞中高表达,但在ICR小鼠卵巢组织细胞中表达较低。理论上,因为该分子很重要和保守,为什么种属间出现差异还有待进一步研究。3.以上实验结果表明Wnt信号通路在小鼠卵泡形成过程中发挥重要作用,可能是通过细胞膜上LRP5/6的磷酸化,促使内膜上DVI3的激活,调控胞内GSK3α,β,激活β-catenin,进而调控核内TCF转录调节因子,开始基因的转录。(二)Wnt/β-catenin信号通路在P OS患者卵丘颗粒细胞中的调控方法:1.PCOS患者采用卵泡期超长降调节促排卵,取卵后收集不同成熟度的卵丘颗粒细胞。2.制备细胞爬片。3.免疫荧光细胞化学法检测卵丘颗粒细胞LRP5/6、DVI3、GSK3α,β、CDH1、CTNNB1蛋白定位。4.Western Blot法检测不同成熟度卵子卵丘颗粒细胞LRP5/6、DVI3、GSK3a,β、TCF-4、CDH1、CTNNB1蛋白表达水平。结果:1.免疫荧光法检测Wnt信号通路蛋白在卵丘颗粒细胞中的定位。(1).免疫荧光法检测LRP5/6、DVI3、GSK3α,β蛋白在颗粒细胞中的定位,结果显示:LRP5/6、DVI3蛋白在颗粒细胞膜上表达,GSK3α,β蛋白在颗粒细胞胞质中表达。(2).免疫荧光法检测CDH1,CTNNB1蛋白在颗粒细胞中的定位,结果显示:CDH1、CTNNB1蛋白在颗粒细胞胞质中表达。2.WB法检测Wnt信号通路蛋白在卵丘颗粒细胞中的表达。(1).WB法检测CDH1,CTNNB1蛋白在颗粒细胞中的表达,结果显示CDH1蛋白含量:MII 组 1.4093±0.2566,GV 组 1.4124±0.0575,GV 组 CDH1 蛋白含量高于MII组,但差异无显著性(P>0.05)。CTNNB1蛋白含量:MII组0.0595±0.0155,GV组0.0588±0.0078,MII组CTNNB1蛋白含量高于GV组,但差异无显著性(P>0.05)(2).WB法检测LRP5/6、GSK3α,β、DVI3、TCF-4蛋白在卵丘颗粒细胞中的表达,结果显示在颗粒细胞中未检测到LRP5/6、GSK3α,β、DVI3、TCF-4蛋白的表达。结论:1.免疫荧光法检测LRP5/6、DVI3、GSK3α,β、CDH1、CTNNBI蛋白在颗粒细胞中的定位,LRP5/6、DVI3蛋白在颗粒细胞膜上表达,GSK3α,β,CDH1,CTNNB1蛋白在颗粒细胞胞质中表达。2.WB结果显示CDH1,CTNNB1蛋白在颗粒细胞中高表达,在不同成熟度颗粒细胞CDH1,CTNNB1蛋白表达无显著性差异。但CDH1蛋白含量随着颗粒细胞成熟呈降低趋势,CTNNB1蛋白含量随着颗粒细胞成熟呈升高趋势。WB结果显示在颗粒细胞中未检测到GSK3α,β、DVI3、TCF-4蛋白的表达,可能需扩大样本量进一步研究。3.以上实验结果表明Wnt信号通路在PCOS患者卵泡形成过程中发挥重要作用。可能是通过细胞膜上LRP5/6的磷酸化,促使内膜上DVI3的激活,进而调控胞内GSK3α,β,激活β-catenin,进而调控核内TCF转录调节因子,开始基因的转录。第三部分Wnt/β-catenin信号通路基因组编辑方法:1.Wnt/β-catenin信号通路基因组编辑载体的构建。2.质粒的转染。3.荧光表达载体通过显微注射导入人类胚胎。4.荧光表达载体颗粒细胞转染。5.人类胚胎基因组编辑方法建立。结果:1.FnCpfl载体构建:针对Wnt/β-catenin信号通路的4个对应基因设计了相关的CrRNA序列并完成了质粒的构建及其活性的检测。2.质粒显微注射入废弃受精卵后能表达对应的荧光蛋白。3.人类颗粒细胞转染效率低。4.重组SaCas9蛋白显微注射后能编辑人类的VEGF基因。结论:1.对Wnt通路中4个对应基因设计了相关的CrRNA序列,成功构建了Wnt/β-catenin信号通路基因组编辑载体,同时在HEK-293细胞中测试到它们具有活性。2.质粒颗粒细胞转染效率低,需优化转染条件(含慢病毒转导)。3.CRISPR/SaCas9能够对人类受精卵进行基因组编辑。