论文部分内容阅读
背景肺癌——呼吸系统最常见的肿瘤,当今世界最常见的恶性肿瘤,具有高发病率,高转移率、高死亡率的特征。大多数患者首次就诊时即被确诊为晚期肺癌,伴有淋巴转移或血行转移。肺癌细胞一旦发生转移就表明其具备了抗脱落凋亡能力,即脱离与基质的联系能够免于凋亡继续存活,最终在远处适宜组织中继续增殖,形成转移。可见,抗脱落凋亡是肺癌转移的始动环节。脱落凋亡/抗脱落凋亡过程是一个非常精密的调控过程,基因网络及其信号通路严密调控这一过程,任何一个基因表达的变化及其信号通路的改变都会影响细胞脱落凋亡/抗脱落凋亡的能力,从而影响细胞的生物学行为。许多肿瘤转移的本质就是由某个介导脱落凋亡/抗脱落凋亡的基因发生改变而引发的。目前对于脱落凋亡/抗脱落凋亡的研究仅限于单个基因或某一通路的改变,没有全面的对全基因组进行分析,从而缺乏系统的、有针对性的研究,本实验将对肺癌A549细胞全基因组进行分析,比较脱落凋亡/抗脱落凋亡两种状态下的基因表达差异,并从中挑选出表达差异最大的基因进一步研究,既全面分析又针对性研究,进一步揭示肺癌细胞脱落凋亡/抗脱落凋亡的分子基础。甲状腺癌相关基因1(Thyroid Cancer gene-1 TC-1),又名c8orf4基因,定位于8P11.2,广泛表达于脊柱动物,高度表达于多种恶性肿瘤组织中;编码一种含106个氨基酸的固有无序蛋白,该蛋白COOH端三个区域(D44-R53, K58-A64, and D73-T88)易形成紧密的螺旋结构,增强其与目的蛋白的结合能力,参与调控Wnt/β-Catenin通路和FGFR2通路,促进细胞癌变和抗脱落凋亡;也参与调控NF-KB通路,介导炎症反应和热休克反应。但是目前对于TC-1基因与肺癌的关系未见报道,本实验结合基因芯片分析结果,应用RT-PCR技术及Western Blot技术检测TC-1基因及编码蛋白在肺癌A549细胞及抗脱落凋亡肺癌A549细胞中的表达,并进一步研究其与肺癌A549细胞抗脱落凋亡的关系,为以后研究TC-1与肺癌转移的分子机制奠定理论基础。目的筛选出肺癌A549细胞抗脱落凋亡相关基因,并探讨TC-1基因的表达和意义。方法应用悬浮培养肺癌A549细胞建立抗脱落凋亡模型;运用DNA电泳检验抗脱落凋亡模型;使用贴壁培养和悬浮培养肺癌A549细胞的总RNA制备人类V2.0全基因组寡核苷酸微阵列芯片(35k human Genome Array);通过基因芯片发现肺癌A549细胞贴壁培养与悬浮培养的差异基因;利用NCBI Pubmed数据库筛选出与肿瘤细胞抗脱落凋亡相关的基因,并从中找出表达差异倍数最大的基因;运用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术及蛋白质印迹(Western blotting)技术测定表达差异倍数最大基因的表达。结果1、成功建立肺癌A549细胞抗脱落凋亡模型。细胞生长状态良好,相互聚集呈团块状,且细胞团块随着时间的延长越大、越紧密;提取其DNA行琼脂糖凝胶电泳分析证实其免于脱落凋亡,具备抗脱落凋亡的能力;2、成功制备肺癌A549细胞贴壁培养和悬浮培养状态下的全基因组芯片——人类V2.0全基因组寡核苷酸微阵列芯片(35K Human Genome Array),并发现肺癌贴壁状态和悬浮状态(抗脱落凋亡状态)存在差异基因745个,这些基因涉及多方面的功能基因和结构基因,进一步分析发现63个与肿瘤细胞抗脱落凋亡密切相关的基因,并筛选出表达差异倍数最大的基因——TC-1基因;3、在基因水平验证TC-1基因在肺癌细胞中表达,且悬浮培养状态较贴壁培养状态高表达,两者之间的差异有统计学意义(P<0.02),并进一步在蛋白水平证实TC-1编码蛋白在肺癌细胞中高度合成,且悬浮培养状态合成更高。结论基因芯片技术为筛选肺癌抗脱落凋亡相关基因提供了有效的方法,肺癌细胞抗脱落凋亡涉及多个基因表达的变化,其中TC-1基因可能参与调控肺癌细胞抗脱落凋亡过程,与肺癌细胞侵袭、转移等行为相关。