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前言:胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤。其发生、发展是一个多基因改变、多因素参与的复杂过程,虽然进行了大量研究,但其分子机制还远不清楚。S100A4是钙离子结合蛋白S100家族的成员之一,本课题组前期研究并报道了8100A4基因与胃癌的关系,证实S100A4高表达与胃癌浸润、淋巴结转移及胃癌细胞体外侵袭力密切相关。但S100A4基因在胃癌中的作用机制仍不十分清楚。研究表明S100A4通过与蛋白相互作用及调控下游基因表达发挥效应。2001年首次发现小鼠乳腺癌细胞中S100A4与突变型p53存在相互作用。P53是体内重要的抑癌基因之一,在多种肿瘤组织中可发生p53突变。突变型p53不仅丧失了野生型p53的肿瘤抑制作用,而且获得一系列类似癌基因特性的功能,其机制与肿瘤细胞中突变型p53蛋白稳定性增加有关。以往认为突变型p53稳定性增加仅为突变本身所致,最近研究提示除突变本身外,肿瘤细胞中的分子病理背景如一些蛋白因子会影响突变型p53蛋白稳定性。目前关于S100A4与突变型p53蛋白的相互作用在人类肿瘤细胞中尚未得到证实,其相互作用对突变型p53的影响及其意义也未见报道。因此我们关注于胃癌细胞中S100A4与突变型p53蛋白的相互作用。本研究中,我们应用免疫荧光细胞化学结合共聚焦检测胃癌细胞内S100A4蛋白与突变型p53蛋白的表达及定位,免疫共沉淀鉴定S100A4蛋白与p53蛋白的相互作用。并应用S100A4shRNA干扰载体转染细胞的方法,检测S100A4对突变型p53表达、转录调节及下游靶基因表达的影响,同时检测S100A4对细胞分化及自噬等功能影响。探讨S100A4与p53蛋白相互作用的特点及意义对理解二者在肿瘤发展中的作用具有重要意义,有助于发现胃癌治疗的新靶点,为肿瘤的靶向治疗提供新线索和途径。
材料与方法:
1、实验材料:人胃癌细胞系MKN1[表达突变型p53(V143A)];克隆载体pMD18-T simple Vector;pSilencerTM4.1-CMV neo vector;大肠杆菌JM109感受态细胞;S100A4 shRNA真核表达载体;pEGFP-C1 vector;pCMV-Neo-Bam p53V143A表达载体。
2、实验方法:应用免疫荧光细胞化学结合共聚焦及免疫共沉淀检测胃癌细胞中S100A4与突变型p53蛋白的相互作用;通过Western blotting及RT-PCR检测S100A4沉默对突变型p53表达的影响;通过Real-time RT-PCR检测S100A4沉默对突变型p53靶基因c-myc、Id2表达的影响;应用Real-time RT-PCR检测共转染S100A4 shRNA表达载体和突变型p53(V143A)表达载体后c-myc、Id2表达;应用染色质免疫沉淀检测S100A4沉默对突变型p53转录调节功能的影响;通过碱性磷酸酶活性检测和GFP-LC3定位分别检测S100A4沉默后细胞分化和自噬功能改变;构建TP53shRNA真核表达载体,应用Western blotting及RT-PCR检测TP53基因沉默对S100A4表达的影响。
结果:
1、免疫荧光细胞化学结合共聚焦检测显示人胃癌细胞中S100A4蛋白与突变型p53(V143A)蛋白存在共定位。免疫共沉淀鉴定了S100A4与突变型p53蛋白的相互作用。
2、S100A4表达沉默后,突变型p53蛋白表达降低,但TP53mRNA表达增高。S100A4表达沉默后,MDM2mRNA表达明显增高,提示S100A4基因沉默通过MDM2促进突变型p53蛋白降解,可能影响其蛋白稳定性。
3、转染突变型p53(V143A)表达载体后,检测发现c-myc mRNA表达升高,Id2mRNA表达降低,初步证实c-myc、Id2为突变型P53(V143A)的靶基因。
4、S100A4基因沉默后,突变型p53靶基因c-mycmRNA表达降低,Id2mRNA表达增高,提示S100A4影响c-myc、Id2的表达。
5、染色质免疫沉淀实验显示S100A4基因沉默后,突变型p53与Id2启动子结合能力减弱,提示S100A4与p53相互作用影响突变型p53转录调节功能,进而调控其靶基因表达。
6、S100A4基因沉默后,细胞碱性磷酸酶活性增高,提示细胞有向成熟方向分化的趋势。
7、S100A4沉默导致胃癌细胞自噬活性增强,这种作用可能是通过突变型p53的介导。
8、TP53基因表达沉默后,S100A4 mRNA和蛋白表达无明显改变。
结论:
1、胃癌细胞内S100A4蛋白与突变型p53蛋白(V143A)存在相互作用;
2、S100A4沉默导致突变型p53蛋白表达降低,提示S100A4可能影响突变型p53稳定性;
3、S100A4影响突变型p53转录调节功能进而调控其下游靶基因c-myc、Id2表达;
4、S100A4抑制胃癌细胞分化及自噬;
5、TP53基因沉默对S100A4表达无明显影响。
前言:侵袭和转移是恶性肿瘤的重要生物学特征,也是导致肿瘤复发和影响预后的重要因素。胃癌患者通常预后很差,其中一个重要原因是肿瘤发生远处转移。因此,研究胃癌侵袭转移的机制具有重要的科学价值和实际意义。S100A4是钙离子结合蛋白S100家族的成员之一,在多种恶性肿瘤中均高表达。本课题组前期研究并报道了S100A4高表达与胃癌浸润、淋巴结转移及胃癌细胞体外侵袭力密切相关。S100A4可能通过增加肿瘤细胞的运动、重塑细胞外基质和促进血管生成等机制在肿瘤侵袭转移中发挥促进作用,但是S100A4促进肿瘤侵袭转移的具体机制仍不十分明确。肿瘤侵袭转移中一个很重要的环节是在失去了和邻近细胞或细胞外基质的接触后,肿瘤细胞仍能存活并增殖。这一环节是肿瘤转移不可或缺的条件。正常上皮细胞具有粘附依赖性,其存活依赖于细胞间和细胞与基质间的信号传递,称为锚定依赖。当粘附性生长细胞失去与细胞外基质和其他细胞的粘附后所发生的一种程序化死亡形式称为失巢凋亡。研究发现很多肿瘤细胞具有抵抗失巢凋亡的能力,可以在循环过程中生存以及进行侵袭、转移。我们推测作为与胃癌浸润转移密切相关的基因,S100A4可能对该环节发挥作用。目前这方面研究尚未见报道。本研究中,我们通过RNA干扰和实验性过表达的方法改变S100A4表达,应用流式细胞术检测失巢凋亡率,应用软琼脂集落形成实验观察细胞非锚定生长,探讨S100A4在胃癌细胞失巢凋亡过程中的作用,并进一步研究了S100A4调控胃癌细胞失巢凋亡的分子机制,为以S100A4为分子靶点治疗胃癌转移提供新的线索和途径。
材料与方法:
1、实验材料:人胃粘膜上皮细胞系GES-1;人胃癌细胞系BGC823、MKN1;克隆载体pMD18-T simple Vector;真核表达载体pcDNA3.1(+);大肠杆菌JM109感受态细胞;S100A4 shRNA表达载体。
2、实验方法:应用Annexin V/PI双染及流式细胞术检测不同细胞系贴壁培养和悬浮培养时的凋亡率;应用Real-time RT-PCR检测GES-1、MKN1和BGC823细胞系中S100A4 mRNA表达;构建pcDNA3.1-S100A4表达载体,通过RT-PCR和Western blotting检测转染S100A4 shRNA表达载体或pcDNA3.1-S100A4表达载体后S100A4 mRNA及蛋白表达;应用AnnexinV/PI双染及流式细胞术检测转染S100A4 shRNA表达载体或pcDNA3.1-S100A4表达载体后细胞失巢凋亡率;应用软琼脂集落形成实验观察S100A4沉默或过表达对细胞非锚定生长的影响;通过RT-PCR和Western blotting检测转染S100A4 shRNA表达载体或pcDNA3.1-S100A4表达载体后整合素α5和avmRNA及蛋白表达。
结果:
1、流式细胞术检测结果表明,悬浮培养24小时后,BGC823细胞失巢凋亡率和贴壁凋亡率比较无明显差异,而MKN1和GES-1细胞失巢凋亡率较贴壁凋亡率明显增高,提示GES-1和MKN1细胞均对失巢凋亡敏感,但BGC823细胞则对失巢凋亡抵抗。
2、Real-time RT-PCR结果表明BGC823细胞中S100A4 mRNA表达水平明显高于GES-1和MKN1细胞,提示S100A4高表达可能与肿瘤细胞对失巢凋亡的抵抗有关。
3、RT-PCR和Western blotting结果表明BGC823细胞转染S100A4 shRNA7天后,与对照组比较,S100A4 mRNA及蛋白表达水平明显下降。转染后细胞失巢凋亡率较对照组明显增高。
4、RT-PCR和Western blotting结果表明胃癌MKN1细胞转染pcDNA3.1-S100A4表达载体48小时后,与对照组比较,S100A4 mRNA及蛋白表达水平明显升高。转染后细胞失巢凋亡率较对照组明显降低。
5、软琼脂集落形成实验检测显示,转染S100A4 shRNA的BGC823细胞与对照组相比,所形成的集落较小、数目也少,两组差异有统计学意义。转染pcDNA3.1-S100A4的MKN1细胞与对照组相比,形成的细胞集落大、数量多,统计分析有显著性差异。
6、RT-PCR和Western blotting结果显示,与对照组比较,转染S100A4 shRNA的BGC823细胞整合素α5和αv mRNA及蛋白表达均明显降低。
7、RT-PCR和Western blotting结果显示,与对照组比较,转染pcDNA3.1-S100A4的MKN1细胞整合素α5和仅αv mRNA及蛋白表达均明显升高。
结论:S100A4通过调节整合素αv和α5表达抑制胃癌细胞失巢凋亡。