家蚕作为一种模式生物,由于其具备吐丝结茧的能力,因而具有很高的经济价值。家蚕的茧层蛋白是由后部丝腺分泌的丝素蛋白和中部丝腺分泌的丝胶蛋白组成,其所占的比例大致为75%和25%。以前的研究认为丝素蛋白是由重链、轻链和P25三种蛋白以6:6:1的比例通过共价键或者非共价键结合形成的复合体,该复合体对丝蛋白在丝腺组织中的分泌、运输和吐丝结茧起到关键性作用。但是从蛋白晶体学的角度看,三种蛋白6:6:1的分子比不尽合理。尽管近些年有研究试图去阐明蚕丝分泌的机制,但到目前为止仍旧有很多难以解释的地方。因此,进一步研究家蚕的泌丝机理具有重要科学意义。另外,近些年CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术的快速发展以及在家蚕中的广泛应用为进一步解析家蚕的泌丝机理提供了一个契机。本研究利用CRISPR/Cas9技术对丝素轻链蛋白基因和丝胶蛋白1基因进行了敲除,随后对突变体和野生型个体进行了比较转录组学和比较蛋白质组学分析及其联合分析,这些结果为进一步阐明丝素轻链蛋白基因和丝胶蛋白1基因的表达模式和功能以及阐明家蚕的泌丝机理提供了参考。本研究的具体结论如下:1.丝素轻链敲除会导致后部丝腺提前退化。利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术成功对秋丰品种家蚕的丝素轻链蛋白基因进行了敲除,并通过连续的选育获得了纯合突变体。在五龄第三天对纯合突变体的丝腺进行了解剖发现后部丝腺出现明显的提前退化现象。另外,对茧壳表型的观察结果发现纯合突变体呈现裸蛹、薄茧层和无法正常化蛹表型。这些结果表明丝素轻链蛋白是蚕丝正常分泌的必要因素。2.转录组分析结果表明纯合突变体后部丝腺中自噬和凋亡的激活导致其提前退化。对五龄第四天的纯合突变体和野生型个体的后部丝腺进行了比较转录组学分析。GO显著富集分析结果表明差异基因在细胞骨架相关条目中显著富集。KEGG显著富集分析结果表明纯合突变体中上调的差异基因在吞噬体和凋亡通路中显著富集。另外,分析了自噬相关的差异基因,结果表明纯合突变体后部丝腺中自噬基因的显著激活。这些结果表明纯合突变体后部丝腺中自噬和凋亡的激活,最终导致了其提前退化。3.蛋白质组分析结果表明纯合突变体后部丝腺中自噬、凋亡和热休克反应的激活导致其提前退化。对五龄第四天的纯合突变体和野生型个体的后部丝腺进行了比较蛋白质组学分析。通过对自噬、凋亡和热休克反应相关的差异蛋白进行分析,结果表明纯合突变体后部丝腺中自噬、凋亡和热休克反应明显激活,这进一步解释了纯合突变体后部丝腺提前退化的原因。4.丝胶蛋白1基因敲除不会影响蚕丝蛋白的分泌。利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术成功对秋丰品种家蚕的丝胶蛋白1基因进行了敲除,并通过连续的选育获得了纯合突变体。在五龄第三天对纯合突变体、杂合突变体和野生型个体的丝腺进行了解剖发现中部丝腺和后部丝腺的表型之间没有明显差异。另外,对茧壳表型的观察结果发现突变体和野生型个体之间没有明显差异。这些结果表明丝胶蛋白1基因敲除不会影响蚕丝蛋白的分泌。5.丝胶蛋白1基因敲除会诱发细胞免疫反应增强。对五龄第四天的纯合突变体和野生型个体的中部丝腺进行了比较转录组学和比较蛋白质组学分析。KEGG显著富集分析结果表明差异基因在病毒性传染病通路上显著富集。另外,对差异蛋白进行了KEGG富集分析,结果表明其在免疫系统和病毒性传染病通路上显著富集。这些结果表明丝胶蛋白1基因表达的大幅度下降会诱发细胞免疫反应增强。6.丝胶1蛋白与一些蛋白酶抑制剂具有协同作用。对从纯合突变体和野生型个体的中部丝腺转录组和蛋白质组比较组学分析中鉴定到的差异基因和差异蛋白进行分析,结果发现大量的蛋白酶抑制剂基因在纯合突变体中部丝腺中显著上调,这表明细胞通过上调蛋白酶抑制剂基因的表达以弥补丝胶1蛋白表达的显著下调。另外,这些上调的蛋白酶抑制剂蛋白均可以在蚕茧中被检测到,表明这些蛋白酶抑制剂的分泌可能受到严格的调控,同时也表明蛋白酶抑制剂和丝胶1蛋白在蚕茧抵抗微生物感染中起协同作用。