本论文的研究源于中药戒毒制剂冰茶栓，它是导师王泽时教授经过多年研制的，以江浙蝮蛇毒为君药的中药复方制剂，能显著控制以疼痛为主的戒断症状。探索江浙蝮蛇毒在戒毒镇痛中所起的作用，对于阐明冰茶栓的作用机理具有十分重要的意义。但江浙蝮蛇毒是一种复杂蛋白，其中每一种蛋白均有不同的药理作用，因此需要从中分离出一种具有良好戒毒镇痛效果的蛋白质，明确其性质，才能进行相关的机理研究。本论文基于此目的，分离筛选出一种江浙蝮蛇毒碱性蛋白质，揭示了它的理化性质、作用途径及对中枢神经递质的调控机理，从而为江浙蝮蛇毒的新药开发奠定了理论基础。 第一部分 冰茶栓靶基因及靶药物的筛选研究 通过冰茶栓药物靶作用的研究，发现冰茶栓能显著控制海洛因依赖猴的戒断症状，同时通过猴大脑中枢纹状体组织的基因芯片研究，找到其有显著性差异表达的基因。用剂量递增法形成海洛因依赖性猴，并进行等级评分，判定猴对海洛因的依赖程度。当形成依赖后，撤药期间，取正常组、阴性组和冰茶栓治疗组猴，从心脏直接注入空气处死，立即取下大脑纹状体，液氮保存。通过总RNA抽提，预杂交和探针标记，将对照组和实验组分别标记Cy3和Cy5荧光，通过荧光信号强度和比值，判断差异表达基因。 戒断评分结果显示：冰茶栓治疗组的分值与阴性对照组有显著差异，但与阳性可乐定组无差异，海洛因依赖猴大脑纹状体基因表达在戒断期和冰茶栓治疗期出现了二个显著性差异基因，分别为前脑啡肽原(Preproenkephalin)和白细胞抗原(HLA-SB(DP)alpha)基因。当猴形成海洛因依赖后，其前脑啡肤原基因表达下调，而经冰茶栓治疗后，其前脑啡肤原基因表达上调，白细胞抗原基因表达下调。提示冰茶栓一方面促进了前脑啡肤原基因的表达，另一方面抑制了白细胞抗原基因的表达，然后达到控制戒断症状的疗效。用均匀设计方法对冰茶栓进行拆方研究，结果提示:江浙蝮蛇毒是冰茶栓中起镇痛作用的靶药物。 第二部分江浙蝮蛇毒组分的分离纯化和镇痛C4组分的筛选及其理化性质研究 探索冰茶栓的主要镇痛活性物质一一江浙蝮蛇毒中可能存在着相关蛋白。采用AKTA一ExPlorer100蛋白质纯化平台，对江浙蝮蛇毒各蛋白质组分进行了提取、分离和纯化，结合镇痛药效和毒性实验筛选最佳镇痛组分;并采用SDS一PAGE、等电聚焦、HPLC等方法获得分子量、等电点和纯度，用紫外光谱及氨基酸序列等进一步明确其理化性质。 分离实验中用阳离子交换柱、阴离子交换柱、分子筛和不同型号的分离介质，对江浙蝮蛇毒的分离效果进行了考察。采用正交设计L，(3’)考察了缓冲液pH、流速、盐浓度等分离参数对分离效果的影响;并用SCoLlting进行方法学考察。确定了先后以离子交换，两种型号分子筛的三步法，最终可获得蛋白质分离纯度为97.5%以上的纯品。 江浙蝮蛇毒经分离纯化，分离出14个蛋白组分，其中酸性组分5个，碱性组分5个，中性组分4个。进行分子筛纯化时，小流速洗脱分离效果最佳。 对分离出的各蛋白组分以小鼠热板法和醋酸扭体法进行E氏，和L氏，的测定。发现一种碱性蛋白质具有较强的镇痛作用和较低毒性，腹腔给药的LD。。为13.33mg/Kg，ED。，为0.63mg/Kg，该组分静脉注射30分钟起效，镇痛强度在5小时达高峰，并持续10小时以上，具有较好的应用价值。编号为C4(为阳离子交换柱分离的4号峰)。 C4组分测定分子量为16.6KD，等电点为8.8，在波长214.16n:和302.Osnm处有最大吸收，在273.09nrn处有最小吸收。H尸LC测定其纯度为92%，具有热不稳定性。该蛋白质N端的前10个氨基酸序列为:H一L一L一Q一F一R一K一M一I一K，经同源性比较，发现它与磷脂酶A2有同源性，但其分子量、HPLC保留时间、热不稳定性均不同于磷脂酶A2。 经大鼠催促戒断试验、大鼠自然戒断试验和C4组分的耐受性试验均表明，C4组分在长期用药过程中不产生身体耐受性和依赖性。 第三部分江浙蝮蛇毒镇痛C4组分的中枢作用研究 江浙蝮蛇毒镇痛C4组分具有镇痛作用，但它是否是中枢镇痛作用?其作用的部位又在哪里?是对其作进一步研究必须回答的问题。因此本实验研究了药物作用之靶区，及其C4组_分对大脑中枢镇痛作用之靶点。 通过纳络酮、利血平、阿托品药物对江浙蝮蛇毒C4组分镇痛作用影响的实验，结果表明:阿托品对江浙蝮蛇毒C4组分的镇痛作用无影响，它不作用于乙酞胆碱受体;利血平对C4组分具有提高痛闲的作用;纳络酮对C4组分的镇痛作用具有部分拮抗效应，说明该组分与阿片受体有一定相关性。小鼠侧脑室给药1/400ED5。即表现良好的镇痛效果，说明C4组分具有中枢性作用。脊髓化鼠模型及大鼠足踢定压刺激法试验也表明C4组分是通过中枢起效的。在停药24小时取吗啡依赖大鼠的各脑区组织，测定发现大脑尾状核、壳核、丘脑、红核、苍白球和中脑导水管灰质等组织的亮氨酸脑啡肤含量明显下降，多数脑区的日内啡肤和P物质含量也有所下降。给予C4组分后，多数脑区的亮氨酸脑啡肤含量增加，尤其以尾状核、丘