维吉尼亚链霉菌IBL14(Streptomyces virginiae IBL14)是一株革兰氏阳性菌,能够高效转化及降解皮质醇、胆固醇、黄铜和孕酮等甾醇类化合物,是本实验室在制药厂周围的污泥中分离并纯化的一株放线菌。在先前的抗生素抗性筛选研究中,发现IBL14菌株能够在含较高浓度青霉素的培养基中生长,而青霉素一般为真菌中的霉菌所产生。为了揭示这种现象,本实验室通过Illumina Hiseq2000平台测序对其全基因组进行了测序,并对测序得到的数据进行过滤、组装和评估,然后依赖数据库GO、KEGG和Swiss-Prot,以及NR和COG对获得的ORF进行基因功能通用注释,最终筛选出7个可能与青霉素代谢相关的酶基因,分别为异青霉素N异构酶(sviipe)、青霉素酰胺酶(svipam1和svipam2)和β-内酰胺酶(svibla1、svibla2、svibla3、svibla4)。CRISPR-Cas系统是原核生物长期进化过程中形成的一种免疫防御机制,广泛存在于古细菌和真细菌中。CRISPR位点是由一系列高度保守的正向重复序列(repeats)和间隔序列(spacer)排列组成的多段R-S结构,其位点附近存在一系列 CRISPR 相关蛋白(CRISPR association protein,cas protein),依据 Cas 蛋白的差异,将其分为两类六型。虽然含有CRISPR-Cas系统的生物近2000种,但能起到基因编辑作用的仅有CRISPR-Cas9和V型Cpf1。CRISPR-Cas系统作为一种新的基因编辑工具,它克服了传统技术的一些缺点,如操作繁琐、耗时长、成本高等,使得基因编辑更加精准、高效、快速。IBL14菌株全基因组组分分析表明,其染色体中存在CRISPR系统。Cas蛋白预测和比对发现,其染色体上含有Cas7、Cas5、Cas3、Cas4、Cas1和Cas2,并且这些蛋白位于同一个操纵子上。其中,Cas3具有DNA剪切作用。因此,本实验室将其命名为I-B-svi型CRISPR-Cas系统。本论文首次应用IBL14菌株自身I-B-svi型CRISPR-Cas系统对青霉素代谢相关酶基因进行编辑,实现了异青霉素N异构酶(sviipe)基因的插入;青霉素酰胺酶(svipam1 和 svipam2)和β-内酰胺酶(svibla1、sviblaa2、svibla3、svibla4)基因的单敲除;青霉素酰胺酶(svipaml)和异青霉素N异构酶(sviipe)以及青霉素酰胺酶(svipaml)和β-内酰胺酶(sviblal)基因的双敲除。编辑中,选择了不同的PAM位点、template和repeat序列。其中,svipam的敲除结果表明,PAM位点为ttc的敲除效率较tcc稍高;svibla1的敲除结果表明,偏长的template敲除效率较短的template敲除效率高,但template短至400 bp同样能实现基因敲除;而CRISPR1和CRISPR2的repeat序列则无明显差异。然后,对青霉素代谢相关酶基因敲除后的菌株进行初步的青霉素抗性检测实验,进一步验证基因敲除的正确性,同时初步验证内酰胺酶基因的功能。在具体实施过程中,仅需要进行编辑模板片段(editing templets)和靶向基因片段(target constructs)的设计,构建出含有向导RNA(single guide RNA)和基因编辑模板的敲除质粒,转化到IBL14原生质体中,筛选得到敲除后的重组子,对重组子染色体进行PCR扩增,再进行PCR产物的测序分析即可。该方法操作简单、耗时短、效率高,不仅为基因编辑提供了一种新的方向,同时也为基因功能鉴定提供了新的思路和方法。