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微孢子虫(microsporidia)是一类专性细胞内寄生的真核单细胞生物,具有广泛的寄主域,包括昆虫、鱼类和人类。家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)是引起家蚕微粒子病的病原,可以经食下和胚种两种途径传染,常给蚕业生产造成巨大的经济损失。虽然有关家蚕微孢子虫的研究取得了较大的进展,但对其侵染致病的分子机制仍然没有完全弄清楚。有研究发现,微孢子虫在激活前,会通过特殊的机制与宿主细胞接近并粘附在宿主细胞上,且微孢子虫的这种粘附作用与宿主细胞的感染有一定关系。作为孢子最早、最直接与宿主接触的部分,微孢子虫表面蛋白在微孢子虫侵染宿主的过程中起到重要作用。层粘连蛋白是重要的细胞外基质成分之一,在基膜的构建及细胞的粘附等方面都有重要的作用。本研究以微孢子虫数据库为依据,通过检索相似物种的层粘连蛋白基因序列,发现家蚕微孢子虫基因组存在层粘连蛋白基因的同源序列,以两个假定的层粘连蛋白α、β亚基(NbHLAMA2、NbHLAMB4)为研究对象,克隆、分析了其序列特征,通过实时荧光定量PCR的方法分析了其转录活性,并进一步通过分子克隆、原核表达,制备了相应的多克隆抗体。利用免疫胶体金技术分析了NbHLAMA2在家蚕微孢子虫中的亚细胞定位,体外宿主细胞粘附实验和抗体封闭实验研究了NbHLAMA2与孢子粘附宿主细胞的关系。通过酵母双杂交系统,以NbHLAMB4作为诱饵蛋白,在家蚕中肠cDNA文库中筛选到与NbHLAMB4相互作用的候选蛋白质。主要研究结果如下:1.NbHLAMA2、NbHLAMB4的克隆及序列分析本研究成功地克隆了家蚕微孢子虫假定层粘连蛋白基因NbHLAMA2、NbHLAMB4,序列分析结果显示:NbHLAMA2的开放阅读框为1704bp,不具有内含子,该基因编码的蛋白质含有568个氨基酸残基,预测分子质量为67.80 kD,等电点为7.99;NbHLAMB4的开放阅读框为1104bp,不具有内含子,该基因编码的蛋白质含有367个氨基酸残基,预测分子质量为43.74kD,等电点为5.72。NbHLAMA2和NbHLAMB4编码的蛋白质结构简单,除了仅有一些糖基化位点之外,只含有一些卷曲螺旋和低复杂度基序,均无信号肽也无跨膜结构域。此外,NbHLAMA2与NbHLAMB4的氨基酸序列相似性为41%,E值为0.23。2.NbHLAMA2、NbHLAMB4的转录特征分析分别提取感染家蚕微孢子虫后不同时期的家蚕中肠总RNA并反转录为cDNA,通过实时荧光定量PCR检测NbHLAMA2、NbHLAMB4基因的转录情况。结果显示,自感染家蚕微孢子虫6h起便可以检测到NbHLAMA2、NbHLAMB4基因的转录本,且之后各时期均可检测到NbHLAMA2、NbHLAMB4基因的转录,这暗示了NbHLAMA2、NbHLAMB4可能在家蚕微孢子虫侵染及增殖过程中均发挥一定的作用。3.NbHLAMA2、NbHLAMB4的原核表达及抗体制备通过分子克隆技术,构建了重组原核表达载体pET30a-NbHLAMA2和pET28a-NbHLAMB4,并将之转化E.coli BL21(DE3)进行融合蛋白诱导表达,获得NbHLAMA2及NbHLAMB4重组蛋白。利用纯化的蛋白免疫动物,制备了相应的多克隆抗体。4.NbHLAMA2的定位分析及功能初探通过免疫胶体金技术,对NbHLAMA2在家蚕微孢子虫成熟孢子中的亚细胞定位进行研究,结果显示NbHLAMA2主要定位在成熟孢子的孢子壁,同时在孢子内部也有分布。宿主细胞粘附实验和抗体封闭实验结果显示:NbHLAMA2蛋白能够识别并结合到宿主细胞表面且抗体封闭后孢子粘附率下降,推测NbHLAMA2蛋白在孢子与宿主细胞的粘附过程中发挥一定作用。5.应用酵母双杂交技术筛选NbHLAMB4互作蛋白应用酵母双杂交技术,以NbHLAMB4作为诱饵蛋白,从家蚕中肠cDNA文库中初步筛选得到了3个可能与NbHLAMB4相互作用的候选蛋白(热休克蛋白、锌指蛋白420类似物、氨肽酶N)。研究结果对理解NbHLAMB4在家蚕微孢子虫侵染家蚕过程中所起的作用及进一步阐明家蚕微孢子虫的侵染机制提供了新的线索。