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研究目的:宫颈癌是严重危害妇女健康的疾病,发病率居我国女性生殖道恶性肿瘤首位。放射治疗是宫颈癌最主要的根治手段之一,放疗抵抗所引起的局部复发及远地转移仍是导致宫颈癌预后不良的重要原因之一,因此,探索促进宫颈癌放射敏感性的相关药物及其所介导的信号通路具有重要意义。铁死亡（ferroptosis）为2012年被首次报道的独立于凋亡坏死等的一种新的细胞死亡形式,其特征主要为二价铁依赖性的多不饱和脂肪酸过氧化产物过度积累所诱发的细胞死亡。相关研究证实铁死亡是放疗杀伤肿瘤细胞的主要机制之一,提示促进铁死亡敏感性在促进恶性肿瘤放射敏感性方面具有巨大潜力,但目前缺乏相关研究。由于胞浆可变铁池是铁死亡敏感性的重要影响因素,因此,本研究的目的是探索提高胞浆可变铁池的水平是否具有放射增敏作用,并对相关作用机制展开研究。方法:1.构建宫颈癌放射抵抗细胞系,与放射治疗前细胞系进行蛋白组学测序寻找差异表达基因,通过蛋白互作网络以及富集分析来验证电离辐射与铁死亡的相关性,并利用GEO数据库中放疗前与放疗后宫颈癌组织测序结果进一步验证。2.通过检测脂质过氧化水平,铁死亡抑制剂以及q PCR检测宫颈癌细胞放疗后的铁死亡相关基因表达情况来验证放疗诱导宫颈癌细胞发生铁死亡。3.验证提高胞浆可变铁池浓度可以通过诱导铁死亡促进宫颈癌的放射敏感性。（1）利用外源性铁离子（硫酸亚铁铵）直接作用于宫颈癌细胞系,并给予放射治疗联合处理后利用平板克隆形成实验验证其放射增敏作用,随后联合铁死亡抑制剂进行回复实验。（2）利用荧光分光光度计检测RSL3作用于宫颈癌细胞后的胞浆可变铁池的浓度,并在蛋白水平检测NCOA4以及铁蛋白的表达水平,q PCR检测转铁蛋白受体（transferrin receptor,TFRC）的m RNA水平,在胞浆铁池浓度升高的时间点给予放射治疗后,利用平板克隆形成实验来验证其放射增敏作用。流式细胞仪检测脂质过氧化水平,并利用铁离子螯合剂以及铁死亡抑制剂进行回复实验。（3）利用荧光分光光度计检测erastin作用于宫颈癌细胞后的胞浆不稳定铁池的浓度,并在蛋白水平检测NCOA4以及铁蛋白的表达水平。在胞浆铁池浓度升高的时间点给予放射治疗后,利用平板克隆形成实验来验证其放射增敏作用。并利用流式细胞仪检测脂质过氧化水平,使用铁死亡抑制剂、NCOA4敲减以及铁螯合剂进行回复实验。4.利用ROS清除剂、脂质过氧化抑制剂及铁螯合剂分别联合erastin作用于宫颈癌细胞系,通过Western blot检测铁蛋白自噬（ferritinophagy）的诱导是否被抑制。随后利用Western blot检测放疗是否诱导宫颈癌细胞发生铁蛋白自噬,并利用荧光分光光度计检测胞浆不稳定铁池的水平。敲减NCOA4,利用平板克隆形成实验检测铁蛋白自噬对放疗的影响。结果:1.在宫颈癌放射抵抗细胞系中抗铁死亡相关基因显著上调,并具有铁死亡抗性。宫颈癌放疗后组织对比治疗前,抗铁死亡相关基因同样发生上调。富集分析及蛋白互作网络均提示铁离子调控的相关通路发生显著变化。间接表明放疗可能诱导了宫颈癌发生铁死亡,而抗铁死亡相关基因上调为适应性反应的结果。2.放射治疗诱导宫颈癌细胞系的脂质过氧化水平的升高,铁死亡抑制剂可以抑制放射治疗的杀伤作用,表明放射治疗可以诱导宫颈癌发生铁死亡。3.胞浆可变铁池浓度升高与放射治疗联合应用会促进宫颈癌发生铁死亡进而提高宫颈癌的放射敏感性。（1）给予外源性铁离子可以有限的促进宫颈癌细胞系的放射敏感性,并且可以被铁死亡抑制剂所逆转,但外源性铁离子对于放疗后存活的宫颈癌细胞却具有显著的促进增殖的作用。（2）RSL3可诱导Siha细胞的转铁蛋白受体（TFRC）发生显著上调,并促进Siha细胞的胞浆可变铁池浓度,在Siha细胞胞浆可变铁池浓度较高的时间点联合放射治疗显著促进脂质过氧化水平,提高其放射敏感性,RSL3的放射增敏作用可以被铁死亡抑制剂以及铁离子螯合剂所逆转。表明RSL3通过上调TFRC诱导的胞浆可变铁池浓度升高促进宫颈癌的放射敏感性。（3）erastin诱导宫颈癌细胞系发生铁蛋白自噬,并导致胞浆可变铁池浓度的升高,在铁蛋白自噬效果最显著的时间点联合给予放射治疗可显著提高宫颈癌细胞系的放射敏感性,敲减铁蛋白自噬的关键基因NCOA4显著抑制erastin的放射增敏作用。铁死亡抑制剂以及铁离子螯合剂均可以逆转erastin对宫颈癌的放射增敏作用。表明erastin通过诱导铁蛋白自噬促进的胞浆可变铁池浓度的升高来促进宫颈癌发生铁死亡,进而提高宫颈癌的放射敏感性。综合以上结果,三种促进胞浆可变铁池浓度的途径均可通过促进宫颈癌的铁死亡敏感性进而促进其放射敏感性。外源性铁离子会增加细胞总铁含量,而对宫颈癌细胞具有双向作用。RSL3诱导的TFRC上调不稳定（仅Siha细胞,而非Hela细胞）,且同样会增加细胞的总铁含量。而erastin所诱导的铁蛋白自噬不增加细胞的总铁含量且稳定诱导,是潜力最高的放射增敏机制。4.ROS清除剂可显著抑制erastin诱导的铁蛋白自噬,而脂质过氧化抑制剂以及铁螯合剂对铁蛋白自噬无抑制作用。表明非铁离子依赖性ROS是诱发铁蛋白自噬的主要机制。放射治疗可以诱导铁蛋白自噬,并促进宫颈癌细胞内胞浆不稳定铁池浓度上升,但敲减NCOA4后并不能够抑制放射治疗的细胞杀伤作用。结论:1.放射治疗可诱导宫颈癌细胞发生铁死亡。2.直接给予外源性铁离子、转铁蛋白过表达以及铁蛋白自噬三种途径所促进的胞浆可变铁池浓度升高联合电离辐射可以显著促进宫颈癌的铁死亡水平,进而提高宫颈癌细胞系的放射敏感性,但给予外源性铁离子同时增加细胞总铁含量,反而促进宫颈癌细胞的增殖能力,而铁蛋白自噬不增加细胞的总铁含量,并可稳定诱导,因此铁蛋白自噬作为放射增敏的策略更为优越。3.非铁离子依赖性ROS是铁蛋白自噬诱发的上游机制,并发现电离辐射可以诱导宫颈癌发生铁蛋白自噬,但该机制的应用需要进一步挖掘。