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临床研究表明干扰素-α(interferon-alpha，IFN-α)是造血系统恶性肿瘤和淋巴瘤的最有效治疗剂之一。然而,IFN-α仅可使约70％～80％的慢粒白血病(又称慢性髓系白血病，chronic myeloid leukemia，CML)患者获得血液学缓解，IFN-α治疗CML的分子机制和CML患者对IFN-α反应性不同的机制尚未阐明。本课题通过细胞和分子水平比较性研究K562和KT-1／A3两种CML细胞系对IFN-α的不同反应，证实KT-1／A3 CML细胞对IFN-α作用敏感，然后采用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization，SSH)分离IFN-α诱导前后的KT-1／A3细胞内差异表达的基因，对这些基因的分析、鉴定将有助于了解IFN-α治疗CML的分子机制。 目的： 通过比较K562和KT-1／A3两种CML细胞系对IFN-α的不同反应性，选用KT-1／A3细胞，采用SSH技术分离IFN-α诱导前后的KT-1／A3细胞内差异表达的基因，为进一步阐明IFN-α治疗CML的分子机制提供直接的实验依据 方法： 1．比较K562和KT-1／A3两种CML细胞系对IFN-α的不同反应性。①采用MTT、半固体集落形成和台盼蓝染色液体培养细胞检测不同浓度IFN-α(100、500、1000、5000和10000IU／ml)对KT-1／A3及K562细胞生长的影响；②IFN-α(1000 IU／ml)诱导KT-1／A3及K562细胞48h后，采用流式细胞分析(FCM)、荧光染色和DNA片段化检测细胞凋亡；③加入IFN-α(1000 IU／ml)培养KT-1／A3及K562细胞48h后，采用相对定量RT-PCR分析bcr／abl基因表达水平。 2．在上述实验的基础上，选用KT-1／A3细胞和IFN-α(1000 IU／ml)诱导KT-1／A3细胞48h，并设对照组，用抑制性削减杂交技术筛选对IFN-α应答的差异性cDNA序列。①分离细胞mRNA，反转录合成cDNA，以IFN-α作用后的KT-1／A3细胞作为检测子，以 未加 IFN－口的 KT上八3细胞作为驱赶于，两组 cDNA都经 Rsa酶 切后，检测子CDNA分两组，与不同接头连接，分别与过量驱赶子， CDNA变性退火杂交，然后合并两组杂交CDNA，重新加入过量的变 性驱赶子CDNA，再次杂交，结果IFN－口诱导组和对照组中基因表 达水平相同的转录子cDNA被杂交消减，而IFN－a诱导表达基因转 录子CDNA被富集，可通过以接头序列为引物的抑制PCR反应扩增， 得到IFN－口诱导应答的差异性。DNA序列，将该差异性CDNA序列与 T／A克隆载体连接后转化大肠杆菌 DHS a，构建 IFN－日诱导差异性 cDNA文库；②通过蓝－白斑和氨芍青霉素（Amp）抗性的双重筛选 后，提取单个的白色克隆质粒，用 ECOR酶切质粒筛选阳性克隆， 再用载体上的Sp6、T7启动子序列为引物，扩增阳性克隆插入片段， 对PCR产物进行双酶切，初步去除重复克隆，筛选出22个不同的 卜性克隆。 3．差异表达基因的鉴定和测序、分析。反向Northern点杂交鉴 定筛选出的 22个不同的阳性克隆，与对照组比较，有 16个阳性克隆 表达上调，测序并与GenBank序列数据库进行同源性比较。 结果： 1．IFN－口呈剂量依赖性（从 100lU／ml 至 10000 I帅l）抑策 KT4八3细胞生长；IFN－口 （100 IU／ml）诱导48h后使 KTl／A3 细胞凋亡率从 3．29％升到 11．8％，并使 KT刁／A3细胞中 her／abl嵌合 基因的表达水平降至对照组的66．7％；IFN－Q对K562细胞的生长、 凋亡及her／abl嵌合基因表达无明显调节效应。 2．将IFNA诱导性表达的cDNA序列克隆入T／A载体后转化 大肠杆菌，筛选获得约80个克隆。利用载体上的酶切位点鉴定得到 50个阳性克隆，片段大小分布于100 ～800hp。 3．反向 Northern点杂交分析确定 16个片段为差异性表达的 CDNA序列。测序后进行同源性检索发现，这些CDNA序列为6个 不同基因的转录产物，大部分基因功能己明确，包括①与细胞增殖 或促进蛋白质合成相关基因，如抑制癌细胞生长的P4762，线粒体 DNA聚合酶合成基因 POLG，参与蛋白质合成起始的 eIF4G；②与 细胞凋亡有关的基因，如 ATP6L，MLC；③未知功能的基因，其作 用有待进一步研究如 FLJ20003。功能上分析这些基因涉及了细胞的 增殖、凋亡、信号转导、蛋白质合成和细胞骨架等几个重要的细胞 生物学代谢反应过程，显示IFN－口在KTl八3细胞中的诱导性基因 二二I的多样性。 结论： 1．不同类型的CML细胞对IFNJ的反应性不同，这些结果为进一步研究IFNA的作用机制提供了直接的实验依据。 2．利用抑制消减杂交技术，从 IFNA诱导前后的 KTl八3细胞的消减CDNA文库中筛选出了部分的IFN－口应答基因，这些基因可能在IFN