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雷公藤是目前所公认治疗RA药物中疗效最好的单味中药,但雷公藤类口服制剂具有较严重的毒副作用,包括肝肾毒性、胃肠道及生殖系统毒性等,限制了其口服制剂的临床应用。而经皮给药制剂具有能直接作用于病灶部位、起效速度快及毒副作用小等优点,是风湿性关节炎治疗中常用的给药方式。有研究表明,与口服制剂相比较,将雷公藤局部经皮给药后,对RA的治疗作用也非常明显,但毒副作用却较小。雷公藤甲素是雷公藤的主要有效成分和相关制剂的质量控制成分,同时也是主要的毒性成分。本课题组前期药效学研究表明,雷公藤甲素单独经皮给药具有一定的皮肤毒性,其与阿魏酸进行组分配伍使用后,对RA的治疗效果与单独使用相似,但皮肤毒性降低,但未对减毒的作用机理进行进一步研究。而皮肤刺激性也是外用制剂首要解决的关键问题之一,阐明配伍应用减轻皮肤刺激性的作用机制对经皮给药制剂的发展及毒性中药的临床应用具有一定的促进作用。本文以体外培养表皮细胞的方式,从皮肤代谢及氧化损伤等方面探讨雷公藤甲素配伍阿魏酸降低皮肤毒性的作用机制,为TP合理的临床应用及外用制剂的开发提供一定的理论依据。本文主要进行了以下研究:1.雷公藤甲素与阿魏酸配伍比例的筛选采用MTT比色法考察了雷公藤甲素与阿魏酸在1:12.5,1:25,1:50,1:100及1:120五个配伍比例下,6h,12h,24h三个给药时长中HaCaT细胞的存活率,以存活率大于90%为安全界限,筛选二者的配伍比例。结果表明,雷公藤甲素对HaCaT细胞的增殖有严重的抑制作用,基本呈现浓度及时间依赖性,随着药物浓度增大及作用时间的延长,其细胞增殖抑制作用也在显著增加。阿魏酸在一定浓度范围内,对HaCaT细胞的生长无明显影响,但高浓度的阿魏酸对HaCaT细胞的增殖有抑制作用。二者配伍使用时,阿魏酸可以降低雷公藤甲素对HaCaT细胞的毒性作用,当雷公藤甲素与阿魏酸的配伍比例为1:100,给药时间为6h时,减毒效果最佳,TP的安全浓度提高7倍。这与本课题组前期采用MDCK细胞筛选的最佳配伍比例结果一致,故最后确定雷公藤甲素和阿魏酸的配伍比例为1:100,药物作用时间为6h进行后续实验。2.阿魏酸对雷公藤甲素在HaCaT细胞模型中代谢特性的影响研究分别采用LC-MS/MS和HPLC法测定了雷公藤甲素和阿魏酸的含量,发现二者在配伍使用后,TP在6h内的代谢转化量会增加,其中高剂量组之间具有显著性差异,配伍中、低剂量组的TP代谢量也高于对应的单独给药组,但差异无统计学意义。说明阿魏酸在一定程度上具有加快雷公藤甲素在HaCaT细胞中代谢的作用。采用“cocktail”探针法,分别以非那西汀、氯唑沙宗及睾酮为探针底物表征雷公藤甲素配伍阿魏酸对HaCaT细胞中CYP1A2,CYP2E1及CYP3A4活性的影响。结果表明,在一定浓度范围内,雷公藤甲素对CYP2E1的活性具有较弱的抑制作用,单独给药组与配伍组比较无明显变化,而雷公藤甲素配伍阿魏酸对CYP1A2和CYP3A4的活性无显著影响。3.雷公藤甲素配伍阿魏酸对HaCaT细胞的氧化损伤保护作用采用酶生化法测定了HaCaT细胞中SOD,GSH,MDA和CAT等抗氧化因子的含量,并将2,7-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA,2,7-dichlorofuorescin diacetate)作为荧光探针进行ROS活性的测定。结果显示,雷公藤甲素高、中、低剂量组中ROS表达量明显增加,显著超过正常细胞中的表达水平,并且基本呈现浓度依赖性。而TP与阿魏酸配伍使用后,各浓度范围下的ROS表达水平明显降低,达到了与正常细胞状态相同的范围,相对维持了角质形成细胞的氧化还原平衡状态。雷公藤甲素也能使得HaCaT细胞中GSH及CAT的含量显著减少,并能明显增强SOD和MDA的活力。而将阿魏酸与TP配伍应用于HaCaT细胞后,能拮抗雷公藤甲素造成的氧化损伤,致使HaCaT细胞中GSH及CAT的含量明显增加,SOD和MDA的活力减弱,使得各氧化因子达到正常稳态水平。以上结果表明,阿魏酸可通过增加GSH及CAT等抗氧化活性成分的含量,减少ROS的产生,相应修复了原本被TP破坏的氧化还原平衡环境,使得HaCaT细胞的抗氧化能力增强,从而对雷公藤甲素诱导的氧化损伤产生保护作用。4.雷公藤甲素配伍阿魏酸对Nrf2蛋白表达的影响采用western blotting法测定了HaCaT细胞中Nrf2蛋白的表达水平,进而验证雷公藤甲素配伍阿魏酸发生氧化损伤保护作用是否通过介导Nrf2而实现。结果显示,雷公藤甲素能够使HaCaT细胞中Nrf2的表达量降低,但作用趋势相对较弱。而TP与阿魏酸配伍使用后,Nrf2的表达水平明显上升,说明阿魏酸可能通过增加Nrf2活力,抑制氧化应激反应而起到对TP诱导氧化损伤的保护作用。结论:雷公藤甲素配伍阿魏酸可能通过增加TP代谢,降低HaCaT细胞中ROS的表达水平,促进Nrf2激活,进而提高了GSH及CAT等关键抗氧化因子的表达,增加表皮的抗氧化能力,从而降低了雷公藤甲素的皮肤刺激性。