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第一部分突变p53通过Egr-1/p300介导电离辐射诱导Cathepsin L表达目的:阐明p53基因突变对电离辐射诱导Cathepsin L的意义,研究Egr-1/p300与突变p53之间的关系,证实在电离辐射作用下Egr-1/p300是突变p53上调Cathepsin L的重要靶点,阐明Cathepsin L是突变p53功能获得的重要参与者。方法:Western blot检测10 Gy电离辐射对不同p53状态的肿瘤细胞的Cathepsin L、Egr-1、p300表达水平的影响;荧光素酶报告基因检测法观察电离辐射对Cathepsin L启动子p53结合区域的活性的影响;染色质免疫沉淀法检测不同状态p53的肿瘤细胞中的p53、p300与Cathepsin L启动子在电离辐射后的结合情况;使用Egr-1或p300干扰RNA处理肿瘤细胞后进行辐照并通过western blot检测细胞中的Cathepsin L表达情况,以及通过荧光素酶报告基因检测法观察干扰RNA对Cathepsin L启动子p53结合区域的活性的影响,通过染色质免疫沉淀法检测干扰p300对突变p53与Cathepsin L启动子之间结合的影响;使用结肠癌细胞株HT-29（p53突变型）和RKO（p53野生型）建立裸小鼠皮下移植瘤模型,并对肿瘤部位进行20 Gy剂量的X射线照射,运用western blot、免疫组化分析法检测不同p53状态肿瘤细胞皮下移植瘤中的Cathepsin L、Egr-1和p300的表达情况。收集结肠癌和乳腺癌临床病例样本,western blot法检测Cathepsin L、Egr-1和p300在样本中的表达水平,对组织样本进行p53基因突变检测,免疫组织化学染色法观察Cathepsin L、Egr-1和p300在野生和突变p53肠癌组织中的表达情况。结果:电离辐射处理后,western blot实验结果显示p53-R273H基因突变的肿瘤细胞 U251、HT-29 和 MDA-MB-468 内的 CathepsinL、Egr-1 和 p300 表达均上调,而p53野生型肿瘤细胞U87、RKO和MCF-7内的相应蛋白表达水平在电离辐射前后没有明显差异;荧光素酶报告基因检测结果显示电离辐射诱导p53基因突变的肿瘤细胞Cathepsin L启动子p53结合区域活性增加;染色质免疫沉淀检测结果显示肿瘤细胞受到电离辐射的情况下,突变型p53与CathepsinL的启动子结合增强;Egr-1和p300干扰RNA能够有效的抑制电离辐射对Cathepsin L的上调,染色质免疫沉淀检测结果显示Cathepsin L的转录过程也依赖于p300与Cathepsin L启动子的结合,干扰p300能够抑制突变p53和CathepsinL启动子的结合。另外,在裸小鼠皮下移植瘤模型中,突变组的放疗效果没有野生组理想;免疫组化分析显示,相较于野生组细胞株,突变组细胞株移植瘤中的Cathepsin L、Egr-1和p300表达均受到电离辐射诱导增加,与细胞实验结果是一致的。在临床结肠癌样本中,与对应的正常癌旁组织相比,Cathepsin L和Egr-1均高表达于癌组织中,乳腺癌组织样本中的Cathepsin L、Egr-1和p300也均高于癌旁组织。另外,p53突变检测结果显示结肠癌样本中有两例的p53突变发生在273位点,相应样本的免疫组织化学染色结果显示Cathepsin L、Egr-1和p300均高于癌旁组织,并且CathepsinL有明显的核转位现象,而p53野生型样本组织中的Cathepsin L核转位现象没有突变样本明显。结论:电离辐射作用下,突变p53能通过诱导转录因子Egr-1/p300调控Cathepsin L的表达。第二部分突变p53细胞的Cathepsin L启动子甲基化状态对电离辐射诱导Cathepsin L转录激活的影响目的:阐明突变p53通过影响Cathepsin L启动子甲基化介导电离辐射诱导的后者的转录激活机制,揭示表观遗传学机制在Cathepsin L基因转录调控中的表现。方法:电离辐射处理不同p53状态的肿瘤细胞后,western blot检测细胞中甲基化转移酶Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b的表达情况,并提取细胞总DNA,通过甲基化特异性PCR（MSP）检测Cathepsin L启动子p53结合位点上游区域的甲基化水平,采用重亚硫酸盐测序PCR（BSP）检测Cathepsin L启动子p53结合位点上游区域甲基化位点的具体变化。结果:western blot结果显示电离辐射上调了 p53突变型细胞的甲基化转移酶Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b的表达水平,甲基化特异性PCR结果显示电离辐射提高了p53-R273H位点突变的胶质瘤细胞U251和肠癌细胞HT-29内的Cathepsin L启动子上p53结合区域上游甲基化水平。进一步利用重亚硫酸盐测序PCR结果显示,p53突变型细胞U251、HT-29的CathepsinL启动子甲基化水平均高于U87细胞,并且,电离辐射对p53突变型肿瘤细胞U251内Cathepsin L启动子上p53结合区域上游甲基化水平增加了 7%,HT-29细胞增加了 5%,而p53野生型胶质瘤细胞U87和肠癌细胞RKO的相应区域甲基化水平辐照前后无明显差异。结论:静态水平下p53突变型细胞Cathepsin L低水平表达与其启动子高甲基化水平相关,电离辐射进一步上调p53突变型肿瘤细胞Cathepsin L的启动子甲基化水平,因此,电离辐射诱导的突变p53细胞CathepsinL的表达可能与其启动子甲基化没有相关性。