【摘 要】
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鸡球虫病（Coccidiosis）是由顶复门（Apicompiexa）、艾美耳属球虫（Eimeria）引起的一种寄生于鸡消化道肠上皮细胞内的寄生性原虫病,其中最常见的病原主要有七种,包括毒害艾美耳球虫（E.necatrix）、柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）、堆型艾美耳球虫（E.acervulina）、布氏艾美耳球虫（E.brunetti）、早熟艾美耳球虫（E.praecox）、巨型艾美耳球虫
【基金项目】
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国家重点研发计划项目（2017YFD0501205）； 国家自然科学基金青年基金项目（31602039）； 江苏省博士后科研资助计划（1601054C）； 扬州市基础研究计划（自然科学基金）青年科技人才项目（YZ2016114）；
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鸡球虫病（Coccidiosis）是由顶复门（Apicompiexa）、艾美耳属球虫（Eimeria）引起的一种寄生于鸡消化道肠上皮细胞内的寄生性原虫病,其中最常见的病原主要有七种,包括毒害艾美耳球虫（E.necatrix）、柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）、堆型艾美耳球虫（E.acervulina）、布氏艾美耳球虫（E.brunetti）、早熟艾美耳球虫（E.praecox）、巨型艾美耳球虫（E.maxima）及和缓艾美耳球虫（E.mitis）。它们适应性强,分布广泛,能够在鸡体内进行无性生殖和有性生殖,感染肠道的不同区域,临床上病鸡多表现为食欲减退、体重减轻、精神沉郁、缩头呆立和出血性腹泻,严重危害养禽业健康发展。其中毒害艾美耳球虫（E.necatrix）寄生于小肠中1/3段,且致病性较为严重。目前,临床上防控鸡球虫病主要依赖传统的药物治疗和疫苗免疫预防两种方法。但前者因耐药虫株、兽药残留和抗生素禁用等问题而得不到广泛应用,从而使得防治鸡球虫病的发展方向更多转向疫苗免疫预防。结合本课题组前期对毒害艾美耳球虫成壁体和卵囊壁蛋白的差异蛋白组学分析显示,EnOXIO1（Oxioreductase of E.necatrix）在成壁体和卵囊壁中的表达量存在明显差异,其中在成壁体内高表达,在卵囊壁上低表达,经GO分子功能注释,EnOXIO1蛋白可能参加了 CH-OH基团释放氢离子的氧化还原反应,促使酪氨酸交联形成坚实的卵囊壁。因此,本研究运用基因工程技术,克隆了毒害艾美耳球虫氧化还原酶蛋白EnOXIO1基因,对重组蛋白rEnOXIO1进行原核表达及免疫荧光定位分析,纯化表达产物并进行动物免疫保护效果评价,旨为研制新型鸡球虫亚单位疫苗奠定坚实理论基础。1、毒害艾美耳球虫氧化还原酶EnOXIO1基因的克隆与序列分析分离纯化毒害艾美耳球虫配子体,提取配子体总RNA,应用RT-PCR法获取EnOXIO1基因序列,对纯化的PCR产物3’端添加“A”碱基,克隆到pGEM-T easy载体进行测序和序列分析。试验结果表明:EnOXTO1基因全长为2535 bp,为一个完整的开放阅读框,共编码844个氨基酸,含有34个抗原决定簇,无信号肽,预测分子质量约为93.51 ku,等电点（PI）为5.917。对毒害艾美耳球虫EnOXIO1蛋白编码氨基酸进行功能预测分析发现:在其氨基酸两端各有一个GMC（Glucose-Methanol-Choline）结构域,其中,氨基端大小为47个氨基酸（158-204位氨基酸）,羧基端大小为70个氨基酸（765-834位氨基酸）,且高度保守;在氨基酸内部有一个FAD/NAD结合域,该区域涵盖了氨基和羧基端2个GMC结构域,预测此类结构域与氧化还原反应中氨基酸间二硫键的形成密切相关。CDS序列比对结果显示:EnOXIO1与其他艾美耳属的氧化还原酶编码基因的同源性由73.6%到99.6%不等。综上所述,得到的EnOXIO1基因为氧化还原酶编码基因,具有高度的种间保守性。2、毒害艾美耳球虫氧化还原酶EnOXIO1基因的原核表达及其在虫体内表达动态分析以测序正确的阳性重组质粒pGEM-T-Easy-EnOXIO1为模板,选取EcoR Ⅰ和Not I两个酶切位点,设计一对特异性引物,成功构建原核表达载体pET-28a（+）-EnOXIO1,转化至大肠杆菌BL21（DE3）,体外诱导表达,纯化表达产物,制备抗rEnOXIO1鼠多克隆抗体,进行免疫荧光定位分析。SDS-PAGE分析显示体外重组表达蛋白主要以包涵体的形式存在,大小约为100 ku,理论分子质量大小约为93.51 ku。Western-blot分析结果显示,该重组蛋白能被鼠抗6×HIS标签单抗特异性识别,同时能被鼠抗rEnOXIO1多抗、毒害艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫病鸡康复血清所识别,表明EnOXTO1具有较好的反应原性和交叉反应原性;同样,在天然配子体蛋白中也能检测到EnOXIO1蛋白。激光共聚焦免疫荧光定位结果证实,EnOXIO1蛋白存在于配子体的成壁体上,并且伴随着卵囊的形成,最终整合到卵囊壁上。实时荧光定量PCR分析结果显示,EnOXIO1在配子体阶段转录水平最高;Western blot检测蛋白表达量结果显示,EnOXIO1蛋白在配子体阶段表达量明显高于其他发育阶段。3、重组蛋白rEnOXIO1的免疫保护效果评价以纯化复性后的重组蛋白与弗氏佐剂混合,经乳化,进行两次免疫接种鸡群。试验共设置5个组,分别为高、中、低三个蛋白剂量组（200、100、50 μg/羽）、未免疫攻虫组（阳性对照组）和未免疫未攻虫组（阴性对照组）,以卵囊产量、卵囊减少率、病变记分、平均增重、病死率和体液免疫水平为指标,评价重组蛋白的免疫保护效果。结果显示:与其他免疫剂量相比,rEnOXIO1高剂量组（200 μg/羽）有较好的免疫保护效果,能够刺激鸡体产生一定水平的体液免疫,提高平均增重,降低卵囊产量和病变记分,且抗球虫指数为172.36,具有中效抗球虫作用。
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