论文部分内容阅读
SAMHD1(SAM domain and HD domain containing protein 1)蛋白作为一种宿主限制因子,因其具备独特的抗病毒功能而成为分子免疫学研究热点。在哺乳动物中,SAMHD1通过水解细胞内的dNTP,耗竭逆转录病毒复制所需的原料从而达到抗病毒功能。除抑制逆转录病毒复制外,SAMHD1还参与了STING介导的细胞凋亡通路,并且作为宿主限制因子,SAMHD1的缺失将导致严重的自身免疫疾病。尽管SAMHD1在哺乳动物中已有较多的研究,但是其在鱼类当中的报道非常少。本研究探索了草鱼SAMHD1的转录调控机制及其在先天免疫信号通路中的功能,另外还初步探索了草鱼SAMHD1在抑制GCRV病毒的作用。本研究首先通过同源克隆及RACE技术克隆获得草鱼SAMHD1的全长cDNA(2792 bp),包括75 bp的5’UTR,833 bp的3’UTR和1884 bp的开放阅读框(ORF),开放阅读框编码一个含628个氨基酸的蛋白。蛋白结构分析表明草鱼SAMHD1与哺乳动物SAMHD1一样具有SAM结构域(核酸结合位点)和HD结构域,并且与其他鱼类SAMHD1的同源性最高。为了研究草鱼SAMHD1在CIK细胞中的表达特征,分别对CIK细胞进行外源或内源的poly I:C、B-DNA和Z-DNA刺激,通过在不同时间段检测草鱼SAMHD1的mRNA和蛋白水平发现:草鱼SAMHD1只会响应内源核酸(poly I:C,B-DNA和Z-DNA)的刺激而表达上调。并且重组草鱼IFN刺激CIK细胞后也能诱导草鱼SAMHD1的表达。这就说明草鱼SAMHD1的表达可能受多条信号通路的调控。为进一步研究草鱼SAMHD1的转录调控机制,在草鱼基因组数据库中找到草鱼SAMHD1的启动子序列,并在线对启动子元件进行了预测,结果发现草鱼SAMHD1启动子包含IRF1、IRF3、ISGF3、NF-kappaB这些潜在结合元件。凝胶阻滞实验表明IRF1、IRF3、IRF9和p65蛋白能够与草鱼SAMHD1的启动子发生结合。qRT-PCR及双荧光素酶报告系统实验证明在CIK细胞中过表达IRF3和IRF9能够上调SAMHD1的转录水平,然而过表达IRF1和p65却不能。相同的结论在敲降IRF1、IRF3、IRF9和p65的实验中也得到了证实。上部分研究表明草鱼SAMHD1的转录受IRF3和IRF9的调控,下部分研究继续探索了草鱼SAMHD1在先天免疫通路中的功能。首先通过亚细胞定位分析发现,草鱼SAMHD1在内源性poly I:C,B-DNA,Z-DNA刺激情况下从细胞核