本研究通过对牛病毒性腹泻病毒Si chuan株（Gen Bank登录号:EU709763）E0基因序列和BVDV V074株（Gen Bank登录号:KX170165）E2基因序列进行融合重组以5型腺病毒为载体构建重组腺病毒载体疫苗,以预防牛病毒性腹泻病的重组新型牛病毒性腹泻病毒疫苗。实验中利用PCR扩增E0、E2目的基因,运用重叠延伸PCR进行E0-E2基因融合、构建腺病毒穿梭质粒p DC316-E0-E2、转染包装成重组腺病毒疫苗Ad5-E0-E2,再通过Western blotting试验验证其反应原性,以及进行病毒滴度的测定。再通过肌肉、皮下免疫接种构建的重组腺病毒载体疫苗Ad5-E0-E2于动物实验,用ELISA方法检测抗体和流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群进行免疫效果试验研究;同时每日记录实验动物的体温、体重、精神状态和饮欲食欲等临床表现,采集实验动物的心脏、肺脏、脾脏、肾脏和肠管做病理组织切片HE染色观察,无菌采集动物组织用BVDV E0-E2基因引物进行PCR检测以研究重组腺病毒载体疫苗的Ad5-E0-E2安全性。通过以上方法获得以下结果。1、牛病毒性腹泻E0-E2基因重组腺病毒载体疫苗构建应用HEK293T细胞增殖BVDV病毒,参照NCBI所发布的Si chuan株（Gen Bank登录号:EU709763）E0基因序列和BVDV V074株（Gen Bank登录号:KX170165）E2基因序列,应用引物设计软件设计E0基因、E2基因的特异性引物并送公司合成,以c DNA为模板应用引物BVDV E0-F/R、BVDV E2-F/R扩增相应目的片段;通过重叠延伸PCR进行E0-E2基因融合并构建重组穿梭载体p DC316-E0-E2,将其与Ad Max腺病毒系统骨架质粒一同转染至HEK293T细胞中进行包装,将包装产物进行Western-Blotting试验进行表达鉴定;最后测量其产物滴度。结果表明:成功扩增到E0、E2基因目的片段,分别为681 bp和1122 bp,通过重叠延伸PCR进行E0-E2基因融合并构建重组穿梭质粒p DC316-E0-E2,将其与Ad Max腺病毒系统的骨架质粒共转染至HEK293T细胞中进行包装得到了完整的腺病毒Ad5-E0-E2;测量其滴度为1.1×1010pfu/m L,;经过Western blotting检测Ad5-E0-E2外源基因在293T细胞中表达,得到了与预期相符的目的条带（65k Da）。2、牛病毒性腹泻E0-E2基因重组腺病毒载体疫苗免疫原性研究选取4 0只6～8周龄SPF级KM白鼠（雌雄各20只）作为评价模型,随机记号并分成4组,每组10只,分为2个实验组和2个对照组（PBS组）。依照制订的接种方法和免疫接种程序进行注射免疫原。免疫前一天、二次免疫前一天、二次免疫后一周实验动物尾部静脉采集血液,分离血清后利用牛病毒性腹泻的ELISA抗体检测试剂盒检测实验动物体液免疫水平;采集二次免疫前一天、二次免疫后一周动物抗凝血利用流式细胞仪测定其CD4+和CD8+T细胞含量检验实验动物的细胞免疫水平。结果表明:构建的重组腺病毒载体疫苗Ad5-E0-E2通过肌肉和皮下注射免疫小鼠能够诱导动物机体产生较高水平的体液免疫和细胞免疫。3、牛病毒性腹泻E0-E2基因重组腺病毒载体疫苗安全性评价选取4 0只6～8周龄、体重18～20g SPF级KM白鼠（雌雄各20只）作为评价模型,随机记号并分成4组,每组10只,分为2个实验组,和2个对照组（PBS组）,依照制订的接种方法和免疫接种程序进行注射免疫原。通过小鼠临床表现观察、病理组织切片HE染色观察和PCR方法检测等方式验证所构建重组疫苗是否对小鼠机体产生损伤,较为系统的评价重组腺病毒载体疫苗Ad5-E0-E2的安全性。结果表明:接种重组腺病毒载体疫苗Ad5-E0-E2后小鼠的精神状态、体温、饮食饮水、行为活动等一切正常未出现明显改变的临床症状和不良反应;无菌采集小鼠内脏器官进行组织病理学染色观察均未发现明显的病理变化;经PCR检测在小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠道均能检测到E0-E2融合基因。