重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus, rAAV)认定为目前最有应用前景的基因治疗载体,并已经被应用多种疾病的基因治疗的临床试验中。此外,世界上第一个以]AAV载体的基因治疗药物——Glybera也已经于2012年底上市。然而,rAAV介导的基因治疗的疗效距离彻底根治疾病还有一段距离,这主要是由于rAAV的转导效率有限。rAAV转导效率不佳,必须使用大剂量的病毒载体。高剂量的rAAV载体导致基因治疗费用的增加,还能诱导患者机体产生免疫反应,影响患者的健康,并可能降低后续基因治疗的疗效,因此,如何进一步优化rAAV的转导效率一直是基因治疗领域研究的热门课题。随着对rAAV生命周期的不断深刻认识,目前已经有一系列提高rAAV转导效率的方法不断被发现、证实和应用,如筛选高效靶向的血清型或者rAAV变体,对rAAV或变体衣壳蛋白表面特定位点的氨基酸残基进行定点突变,构建双链互补AAV (self-complementary AAV, scAAV),在 rAAV衣壳蛋白表面某些位点连接特异性的化学基团或生物素、亲和素,使用蛋白酶体抑制剂或糖皮质激素类药物等。尽管如此,在rAAV从包装、感染细胞到实现目的基因在靶细胞中稳定表达的过程中,尚有一些环节被忽视,还有很多疑问没有确切的答案。例如在包装过程中,顺式作用元件ITR与反式作用因子Rep对rAAV载体的包装效率、转导效率有影响吗?现已知在rAAV感染细胞的过程,若固定细胞密度,提高感染复数(Multiplicity of infection, MOI)可以增加rAAV的转导效率,但是在固定MOI的情况下,增加细胞密度会使转导效率增加还是降低呢?除此之外,中医药具有独特的辨证论治体系,且中药包含的药物种类多、作用靶点广,那么,可以借助于中医理论的指导,通过药物筛选,寻找到其他提高rAAV载体的转导效率的方法吗?本研究主要针对以上这些疑问和思考,探究提高rAAV载体转导效率的新方法,并对其在基因治疗中的具体应用展开研究,为这些方法在更大范围内的推广应用提供理论基础。(一)Rep3和ITR3在优化rAAV3包装和转导效率中的应用构建含有相同Cap3基因但不同反式作用因子(Rep2或Rep3)的质粒pAAVR2C3、pAAVR3C3,以及含有相同目的基因但不同顺式作用因子(ITR2或ITR3) 的 质 粒pITR2-CMVp-hrGFP、pITR3-CMVp-hrGFP、 pITR2-CMVp-EGFP-Neo、pITR3-CMVp-EGF-Neo,酶切鉴定及测序后开始实验。采用聚乙烯亚胺(Polyetherimide, PEI)法将等量的质粒转入HEK293细胞,采用Western Blot法分析Rep、Cap蛋白表达差异；使用荧光显微镜分析目的基因的表达差异。使用三质粒包装法,将质粒转染进入HEK293细胞,qPCR方法分析目的基因复制效率的差异及包装效率的区别。使用Rep2ITR2、Rep3ITR3包装出来的ssAAV3-ITR2-CMVp-EGFP-Neo、 ssAAV3-ITR3-CMVp-EGFP-Neo感染人肝癌细胞Huh7、LH86,使用荧光显微镜观察并分析转导效率。(二)细胞密度对rAAV转导效率的影响通过固定感染体积,调整细胞数目,或固定细胞数目,调整感染体积来提高细胞密度,在K562细胞感染过程中按照不同的细胞密度,或感染过程中、感染过程后分别使用高低细胞密度,使用scAAV6-CBAp-EGFP或ssAAV6-CBAp-EGFP感染细胞,使用荧光显微镜和流式细胞仪分析转导效率,qPCR法分析病毒拷贝数。在K562高细胞密度的情况下,使用不同MOI的scAAV6-CBAp-EGFP感染细胞,使用荧光显微镜和流式细胞仪分析转导效率。将HEK293、K562、Raji三种细胞按照高、低细胞密度铺板scAAV2-CBAp-EGFP感染细胞,使用荧光显微镜和流式细胞仪分析转导效率。使用含有HSPG、FGFR1荧光抗体,借助流式细胞仪,分析rAAV2受体、共受体在HEK293、K562、Raji细胞表面的表达差异。将人造血干细胞按照高、低细胞密度铺板,scAAV2-CBAp-EGFP或scAAV6-CBAp-EGFP,scAAV2-4M-CBAp-EGFP或scAAV6-3M-CBAp-EGFP感染细胞,使用荧光显微镜和流式细胞仪分析转导效率。(三)蟾毒灵对rAAV转导效率的影响及机制分析ssAAV2-CBAp-EGFP、scAAV2-CMVp-hrGFP、scAAV2-4M-CBAp-EGFP载体感染HEK293、HeLa细胞,在感染过程中,同时加入DMSO、蟾毒灵、MG132,或将MG132与蟾毒灵联用,使用荧光显微镜和流式细胞仪分析转导效率,WesternBlot方法分析细胞内泛素蛋白含量差异。C57小鼠腹腔注射DMSO或蟾毒灵,连续10天,并在第6天尾静脉注射ssAAV8-CBAp-fluc-EYFP (1×109vgs),病毒注射2周后,使用活体成像仪分析rAAV8报告基因的表达。(四)紫草素对rAAV6在人造血细胞中的转导效率的影响及机制分析scAAV6-CBAp-EGFP感染K562细胞,并在感染的过程中,加入DMSO、紫草素、蟾毒灵、MG132、抗氧化剂NAC,或紫草素与NAC联合使用,使用荧光显微镜和流式细胞仪分析转导效率。scAAV6-CBAp-EGFP、scAAV2-CBAp-EGFP分别感染K562、HEK293细胞,并在感染的过程中,加入蛋白酶体抑制剂、蛋白酶抑制剂等,使用荧光显微镜和流式细胞仪分析转导效率。使用DHE染料,借助流式细胞仪分析细胞内活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS),用qPCR分析细胞内的rAAV基因拷贝数,Western Blot方法分析细胞内泛素蛋白的含量。scAAV6-CBAp-EGFP感染人造血干细胞,在感染的过程中,加入DMSO、紫草素、MG132,使用荧光显微镜和流式细胞仪分析转导效率。(五)甘草酸铵盐和五味子素对rAAV稳定转导后的基因表达效率的影响C57小鼠尾静脉注射ssAAV2-CBAp-Fluc-EYFP (5×108vgs)、 ssAAV8-CBAp-Fluc-EYFP (5×108vgs)、ssAAV8-CBAp-Fluc-EYFP (5×109vgs)或scAAV8-CBAp-Gluc (5×108vgs)。2个月后,小鼠腹腔注射DMSO、甘草酸铵盐、五味子甲素等,并在注射前后,使用活体成像仪或使用荧光素酶试剂盒检测报告基因的表达。scAAV2-CBAp-EGFP感染HEK293细胞,24h后,向细胞中加入甘草酸铵盐和五味子素,使用荧光显微镜观察及流式细胞仪进行分析。(六)统计方法实验数据结果用均数±标准差(x±SD)表示,采用SPSS 16.0统计软件分析。在评价蟾毒灵、紫草素、甘草酸铵盐或五味子素的单因素不同浓度之间的差异时,使用方差分析的方法。分析两组间差异时,若方差齐,则用Student’s t检验讲行分析；若方差不齐,则使用非参数方法中的Mann-Whitney U检验进行分析。P<0.05为差异有统计学意义。三、研究结果(一)Rep3和ITR3在优化rAAV3包装和转导效率中的应用1. 质粒的构建及其转染效率的分析反式作用因子Rep2与Rep3蛋白的表达量相近；顺式作用元件ITR2与ITR3所介导的目的基因所表达的绿色荧光表达无明显差别(P>0.05,P>0.05)°2. 反式作用因子对携带有顺式作用原件的目的基因的复制效率的影响在使用Rep2的情况下,ITR2与ITR3所介导的目的基因的DNA拷贝数没有明显差别；在使用Rep3的情况下,pITR2-CMVp-hrGFP与pITR3-CMVp-hrGFP之间的DNA拷贝数没有区别(P>0.05),但pITR2-CMVp-EGFP-Neo的含量却明显低于pITR3-CMVp-EGF-Neo,二者之间具有明显的统计学差异(P<0.01)。3. 顺式作用元件及反式作用因子对rAAV载体包装效率的影响与Rep2ITR2包装出来的ssAAV3-CMVp-EGFP-Neo的数目相比,Rep2ITR3与之无明显区别(1P>0.05),Rep3ITR2减少(P<0.05),但Rep3ITR3增加,约为Rep2ITR2组的4.5倍(P<0.01)。4. 顺式作用元件及反式作用因子对包装出来的rAAV载体的转导效率的影响由Rep2ITR2包装出来的ssAAV3-ITR2-CMVp-EGFP-Neo在Huh7、LH86细胞的绿色荧光强度均明显低于由Rep3ITR3包装出来的ssAAV3-ITR2-CMVp-EGFP-Neo载体(P<0.01,P<0.01)。(二)细胞密度对rAAV转导效率的影响1. 细胞密度对rAAV6在K562细胞中转导效率的影响在固定MOI的情况下,随着K562细胞密度的增加,荧光阳性细胞百分比、细胞平均荧光强度在一定的范围内随着细胞密度的增加而增加。K562高细胞密度组中的荧光阳性细胞百分比、细胞荧光强度均明显高于低细胞密度浓缩组(P<0.01,P<0.01)；高细胞密度稀释组的平均荧光阳性细胞百分比、平均荧光强度,明显高于低细胞密度浓缩组(P<0.01,P<0.01)。K562高细胞密度组中的荧光阳性细胞百分比、细胞荧光强度均明显高于低细胞密度组(P<0.01,P<0.05),且高密度细胞组rAAV6的含量为低细胞密度组的4.3倍,二者的差异具有统计学意义(P<0.01)。随着体积的增加,K562荧光阳性细胞百分比、细胞荧光强度逐渐下降,且50μL、500μL组中细胞的病毒拷贝数均较1mL组明显高,其差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.01)。在K562高细胞密度的情况下,当MOI低至300,甚至30时,rAAV6也能顺利实现在K562细胞中的转导。2. 细胞密度对rAAV2在HEK293、K562及Raji细胞中转导效率的影响在相同的MOI和细胞密度的条件下,荧光阳性细胞百分比、细胞荧光强度从高到低的顺序分别为]HEK293、K562、Raji;在相同MOI的情况下,当细胞密度增加时,HEK293细胞荧光阳性细胞百分比、细胞荧光强度不增加,但K562、Raji细胞的细胞荧光阳性细胞百分比、细胞荧光强度却明显增加(P<0.01,P<0.01)。HEK293细胞中的受体HSPG、共受体FGFRl含量最高,K562细胞中的受体HSPG含量次之,Raji细胞中的受体HSPG含量最低,K562、Raji细胞中的共受体FGFR1含量相当。3. 细胞密度对rAAV2、rAAV 6在人造血干细胞中的影响在相同的MOI情况下,人造血干细胞高密度细胞组的荧光阳性细胞百分比、细胞荧光强度均高于低密度细胞组；在使用相同病毒数的情况下,高密度细胞组的荧光阳性细胞百分比、细胞荧光强度均高于低密度细胞组。rAAV突变体scAAV2-4M-CBAp-EGFP、scAAV6-3M-CBAp-EGFP载体所介导的人造血干细胞的荧光阳性细胞百分比、细胞荧光强度分别高于野生型的rAAV scAAV2-CBAp-EGFP、scAAV6-CBAp-EGFP载体。(三)蟾毒灵对rAAV转导效率的影响及机制分析1. 蟾毒灵在体外对rAAV转导效率的影响与对照组DMSO相比,蟾毒灵作用后HEK293、HeLa细胞的绿色荧光像素明显增加。2. 蟾毒灵在体外提高rAAV转导效率的机制研究经蟾毒灵、MG132处理后的细胞的绿色荧光像素比对照组DMSO处理后的细胞明显升高(P<0.05,P<0.01),荧光阳性细胞比例、细胞荧光像素增加。当二者联用后,细胞的绿色荧光像素进一步增加,明显高于单独使用蟾毒灵或MG132组(P<0.05,P<0.05)。经MG132处理后的HeLa细胞中积累的泛素蛋白含量明显增加,但蟾毒灵处理后的HeLa细胞的泛素蛋白含量与对照组相当。3. 蟾毒灵在体外对rAAV转导效率的影响蟾毒灵处理后的C57小鼠的萤火虫萤光素酶含量与对照组之间没有明显差异(P>0.05)。(四)紫草素对rAAV6在人造血细胞中的转导效率的影响及机制分析1. 紫草素对rAAV6在K562中转导效率的影响紫草素作用后的K562细胞的荧光阳性细胞百分比、细胞荧光强度最强,且具有一定的剂量依赖趋势。2. 蛋白酶体抑制剂、蛋白酶抑制剂对rAAV6在K562细胞中转导效率的影响蛋白酶体抑制剂MG132对rAAV2、rAAV6载体在K562细胞的荧光阳性细胞百分比、细胞荧光强度无明显影响,但却能够明显提高rAAV2、rAAV6在HEK293细胞中的荧光像素。卡非佐米可以明显提高rAAV6感染后的K562细胞的细胞荧光强度(P<0.01),对荧光阳性细胞百分比没有影响。3. 紫草素提高rAAV6在K562细胞中转导效率的机制研究抗氧化剂NAC对rAAV6感染后的K562细胞的细胞荧光阳性细胞比例、细胞荧光强度无明显影响(P>0.05,P>0.05),但却可以明显降低由紫草素所引起的荧光阳性细胞比例、细胞荧光强度升高(P<0.01,P<0.01)。紫草素可以增加细胞内ROS含量,而在此基础上联用NAC后,细胞内ROS含量降低,与DMSO组相当。紫草素、紫草素与NAC联合对细胞内的病毒拷贝数无影响。卡非佐米、MG132均可以引起细胞内的泛素积累,且这种泛素蛋白积累的程度远高于紫草素。4. 紫草素对rAAV6在人造血干细胞中转导效率的影响紫草素可以增加人造血细胞的细胞荧光强度,且其作用优于MG132。(五)甘草酸铵盐和五味子素对rAAV稳定转导后的基因表达效率的影响1. 提高rAAV稳定转导后基因表达效率的中药单体的体内筛选与对照组DMSO相比,甘草酸铵盐、五味子素注射后,小鼠的萤火虫萤光素酶含量较注射前明显升高(P<0.05,P<0.05)。2. 甘草酸铵盐和五味子素在体内对稳定转导的rAAV的基因表达效率的影响甘草酸铵盐、五味子甲素能够增加低剂量的ssAAV8-CBAp-Fluc-EYFP或s c AAV8-CBAp-Gluc (5×108vgs)稳定转导的小鼠体内的萤火虫萤光素酶或高斯荧光素酶含量,而对高剂量的ssAAV8-CBAp-Fluc-EYFP (5×109vgs)稳定转导后的小鼠的萤火虫萤光素酶的含量无影响。3. 甘草酸铵盐和五味子素在体外对稳定转导的rAAV的基因表达效率的影响甘草酸铵盐和五味子素对稳定转导scAAV2-CBAp-EGFP的HEK293细胞的基因表达效率无影响。四、 研究结论为进一步增强rAAV载体的转导效率,本课题在中医理论的理论指导下,借助于中药种类多、作用靶点广的优势,进行了中药单体筛选,并结合rAAV载体自身优化中较少被研究的因素,探究提高rAAV基因治疗疗效的新方法,取得了一定的研究成果,值得推广并应用。与目前最常用的包装生产rAAV3所使用的顺式作用元件ITR2、反式作用因子Rep2相比,Rep3与ITR3能够明显增加rAAV3的包装效率,且进二步提高病毒的转导效率。在rAAV的过程中,增加细胞密度可以使细胞内的rAAV基因组含量增加,转导效率不断提高,并且这种提高作用对多种悬浮细胞(K562、Raji)、多种血清型(AAV2、AAV6)以及单双链rAAV载体均有效。此外,使用这种提高细胞密度的方法可以有效提高rAAV载体在人造血干细胞中转导效率。通过与目前已经被研究证实了具有提高rAAV载体转导效率的中药单体—雷公藤红素、扁塑藤素、紫草素等药物进行比较和筛选,我们发现：蟾毒灵可以在体外提高rAAV的转导效率,且其机制可能不同于目前报道最多的抑制蛋白酶体活性,但其体内疗效不佳；紫草素可以通过增加细胞内活性氧的途径,增加rAAV在人造血系统细胞,尤其是人造血干细胞中的转导效率。针对目前关于如何实现rAAV稳定转导后的基因表达效率研究甚少,我们创新性地结合中医理论,筛选对rAAV主要靶器官——肝脏具有调节作用的中药的主要单体,结果显示：甘草酸铵盐和五味子素虽然在体外不能够提高稳定转导rAAV后的细胞的基因表达效率,但是却可以明显增加rAAV稳定转导的小鼠的基因表达效率,且这种提高作用并不受血清型、报告基因以及单双链的限制。