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淀粉分支酶（1,4-α-glucan branching enzyme;GBE;EC 2.4.1.18）是属于糖苷水解酶家族13（GH 13）的一类糖基转移酶,能够催化淀粉分子α-1,4-糖苷键的断裂形成游离短链,并通过转糖苷作用将切割下的短链以α-1,6-糖苷键的形式连接于受体链上,在淀粉分子原主链上形成新的α-1,6-分支点。通过转糖基反应,GBE能够增加淀粉的分支度,提高淀粉的抗消化性和慢消化性,延缓淀粉的回生过程,增强淀粉的稳定性并改善淀粉的使用性能,可用于生产具有良好应用价值的淀粉衍生物。因此,该种酶在淀粉工业中具有广阔的应用潜力。目前,大部分来源的GBE热稳定性相对较差,限制了其在淀粉工业中的应用。为了克服这一弊端,着力于提高GBE的热稳定性成为了扩展GBE工业化应用的研究关键点和热点。本论文研究了来源于Geobacillus thermoglucosidans STB02的GBE的生化性质,深入探究了金属离子与酶蛋白分子表面之间静电相互作用和酶分子内部静电相互作用（即盐桥）两方面对GBE热稳定性的影响。结果显示,加强酶分子外部的静电相互作用（金属离子和酶分子表面氨基酸之间）显著提升GBE的热稳定性。依据此现象,通过序列比对、结构分析和基因删除策略构建具有更高热稳定性的GBE的C末端缺失型突变体,并进一步证实溶剂中金属离子与GBE分子表面氨基酸残基之间存在较强的静电相互作用;另一方面,以酶分子内部静电相互作用（即盐桥）的生物信息学分析为基础,通过在GBE内部构建盐桥,从而强化GBE内部静电相互作用,提高了GBE的热稳定性。与此同时,对GBE分子表面和内部的静电相互作用对GBE热稳定性影响的机理进行了系统研究。主要研究成果总结如下:（1）对重组GBE的生化性质进行了分析,结果表明,该酶的热稳定性较差,在65?C下的半衰期只有约6.9 min,不利于淀粉高温糊化过程中GBE的应用,因此,有必要着力改善GBE的热稳定性。研究显示,GBE的活力和稳定性受溶剂中金属离子影响较大,去除溶剂中金属离子（添加不同浓度EDTA）和在溶剂中额外添加不同类型金属离子对GBE的活力和稳定性产生显著影响。其中,钾离子和钠离子对GBE的活力具有激活作用,钙离子、钴离子、镍离子、铜离子和铁离子等不同程度地抑制GBE的活力。进一步研究发现,0.5 mM的钾离子和1.0 mM的钠离子能显著提升GBE的热稳定性。钾、钠离子能够提高GBE的热稳定性,可能是通过钾、钠离子结合于酶分子中金属离子结合位点或聚集于酶分子表面形成静电相互作用这两种机制,以此达到稳定酶分子空间构象的目的。然而,本研究所使用GBE结构中未发现有特定金属离子结合位点。钾离子和钠离子具有提高GBE热稳定性的作用,更可能是通过钾、钠离子聚集于GBE分子表面与其产生静电相互作用,并形成金属离子-酶分子的静电网络结构这种机制达到。甘油分子可以排除酶分子周围的水分子,减少水分子与酶分子表面的接触,强化金属离子与酶分子表面之间的静电相互作用。结果显示,甘油的加入进一步提高了GBE的稳定性,暗示加强GBE分子与溶剂中金属离子之间的静电相互作用可以提高GBE的稳定性。（2）GBE分子表面的静电相互作用可能形成于金属离子与酶分子表面带电荷氨基酸残基之间。对比、分析来源于G.thermoglucosidans STB02的GBE(GBEGt)和Escherichia coli的GBE(GBEEc)的一级序列和结构发现,相比于GBEEc,GBEGt的C末端延伸出26个氨基酸残基,且该区域中约50%的氨基酸残基为带电荷氨基酸残基,可能与溶剂中金属离子形成静电相互作用。以这26个氨基酸残基为基因删除对象,构建删除这26个氨基酸残基的C端缺失型突变体GBEGt（35）C。对比研究GBEGt和GBEGt（35）C性质发现,这两种酶具有相似的催化特性,但GBEGt（35）C具有更强的热稳定性,其Tm比GBEGt高约5°C。另外,GBEGt（35）C具有比GBEGt更强的恢复性,在各自Tm下保温后,GBEGt（35）C的恢复溶解性能力约为GBEGt的2倍。研究还发现,GBEGt和GBEGt（35）C的活力对EDTA和金属离子的响应值不同,GBEGt（35）C不仅对EDTA具有更强的耐受性,还对金属离子有更低的响应值。GBEGt（35）C可以稳定地存在于不含金属离子的溶剂中,而GBEGt在同等条件下则呈现出聚集状态。机理分析显示,GBEGt和GBEGt（35）C对EDTA和金属离子响应值及其热稳定性的差异可能是由于删除GBEGt的C末端26个氨基酸残基所引起的GBEGt在溶剂中的分布状态发生变化,且这种变化导致两种酶嗜热机制的不同。具有完整序列的GBEGt与溶剂中金属离子之间存在静电相互作用,加强这种静电相互作用有利于具有完整序列GBEGt的稳定性。（3）先前的研究表明加强酶分子外部的静电相互作用可以提高GBE的热稳定性,而强化酶分子内部的静电相互作用（即盐桥）也可能对GBE的热稳定性产生一定影响。实验首先对蛋白分子内部盐桥在生物中分布的普遍规律进行了研究。通过生物信息学分析和统计学方法对盐桥的特性进行分析,总结出适用于蛋白分子内构建盐桥的基本规律。在此基础上,从生物进化学的角度发现,盐桥中一个氨基酸残基为保守时,该盐桥中所涉及的另一个氨基酸残基超过80%的几率是保守的;相反,盐桥中一个氨基酸残基为非保守时,该盐桥中所涉及的另一个氨基酸残基只有10-20%的几率是保守的。此外,盐桥对其所处区域的遗传稳定性有重要意义:当一对盐桥为保守时,该盐桥所处区域的氨基酸残基的遗传稳定性为61-100%;相反地,当一对盐桥为非保守时,该盐桥所处区域的氨基酸残基的遗传稳定性不高于45%。以上研究从遗传稳定性的角度,证明了盐桥对蛋白分子稳定性具有重要作用,并暗示对蛋白分子稳定性贡献较大的盐桥更可能出现于遗传稳定性较强的区域中。（4）依据蛋白分子内部盐桥生物信息学特征,在GBE分子中筛选出符合盐桥形成条件的氨基酸残基位点进行突变,构建了一系列旨在提高GBE热稳定性的盐桥突变体。构建于GBE?-螺旋结构中的盐桥H224E、H224D、Q231R、Q231K、T339E和T339D,强化了盐桥所处区域的稳定性并增强了GBE的耐热性,使GBE在60?C下的半衰期t1/2（min,60°C）分别延长约40%、38%、21%、26%、16%和21%;构建于GBE的?-折叠结构中的盐桥V37E、V37D、G98E、G98D和I571D显著地提高了GBE的热稳定性,使GBE在60?C下的半衰期t1/2（min,60°C）分别延长约80%、88%、95%、109%和52%;而构建于GBE无规卷曲中的I266E则对GBE的热稳定性贡献较小,表明在GBE中强化无规卷曲结构对GBE的热稳定性不产生显著影响。（5）在此基础上,进一步构建了在GBE的?-螺旋和?-折叠结构中涉及到三个带电荷的氨基酸残基的盐桥,即网络盐桥。结果显示,构建于GBE?-螺旋结构中的网络盐桥Q231R-D227-D131H、Q231K-D227-D131H、T339E-K335-I291H和T339D-K335-I291H可以在原有盐桥的基础上进一步强化该盐桥所处区域的稳定性,进而提高GBE的热稳定性。而构建于GBE?-折叠中结构中的网络盐桥I571D-R569-R617H,虽然进一步加强了该区域的结构稳定性,但未在原有盐桥的基础上进一步提升GBE的热稳定性。具有较高热稳定性的C末端缺失型突变体GBEGt（35）C和盐桥突变体用于改性淀粉,使淀粉在获得同等效力的抗消化和慢消化性时,减少了改性过程中酶的添加量,提高了淀粉分支酶的使用性能。另外,在淀粉糊化后降温过程中,具有较高热稳定性的突变体GBE可以相对较早地添加到淀粉糊化乳中,缩短反应时间并减少反应过程中的能耗。此外,通过删除GBE的C末端氨基酸残基部分片段和在酶分子内部理性构建盐桥的手段,进一步丰富了淀粉酶热稳定性的改造策略。