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鲍曼不动杆菌(Acintobacter baumannii,AB)是一种非发酵革兰阴性球杆菌,广泛分布于水、土壤中、尤其是医院环境中。鲍曼不动杆菌常引起医院获得性肺炎、菌血症、脑膜炎、烧伤创伤后大面积伤口感染、泌尿系统感染等。近年来随着抗生素的广泛使用,鲍曼不动杆菌多重耐药菌株不断出现,成为医院内感染重要的条件致病菌之一。一、鲍曼不动杆菌生物膜形成能力与耐药性的相关性分析细菌获得耐药性可能导致其毒力发生改变,鲍曼不动杆菌耐药株往往形成生物膜的能力更强,但也有相反结论的报道。为探究鲍曼不动杆菌耐药性与生物膜形成能力的关系,首先根据ATCC19606标准株基因组信息设计了鲍曼不动杆菌16S rRNA基因的引物,对课题组收集的ATCC19606标准株和68株临床分离株进行了 16S rRNA基因的PCR扩增和序列分析,确认是否为鲍曼不动杆菌。用纸片扩散法或微量液体稀释法检测这些菌株对9类21种抗生素的敏感性,用0.5%结晶紫染色定量法测定其生物膜形成能力,用t检验统计学方法分析细菌耐药水平与生物膜形成能力间的相关性。结果显示,68株临床分离株中混杂有1株肺炎克雷伯菌,其余67株均为鲍曼不动杆菌。这67株和ATCC19606标准株只对米诺环素保持100%敏感性,其他抗生素都出现了耐药菌株,对14种抗生素的耐药率大于50%,多重耐药株和广泛耐药株比例高达92.65%。目前首选治疗药物美罗培南的耐药性达65.71%,最后防线药物多粘菌素B的耐药性已达74.29%。94.12%的分离株可形成生物膜。β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂复合物(氨苄西林/舒巴坦)与四环素类(四环素与多西环素)耐药株较非耐药株的生物膜形成能力强,具有统计学意义。青霉素类、头孢类、碳青霉烯类、氨基糖苷类、喹诺酮类、脂肽类、叶酸代谢途径抑制剂等耐药菌株较非耐药菌株的生物膜形成能力略强。这些结果提示,我们收集的鲍曼不动杆菌在获得耐药基因的同时可能也获得了生物膜形成相关基因,有利于增强细菌在药物环境中的适应能力以及对宿主的感染能力。二、鲍曼不动杆菌CRISPR-Cas系统的筛查及其对靶基因的调控作用分析鲍曼不动杆菌耐药性及毒力的获得与水平基因转移有关,而细菌CRISPR-Cas系统则对水平基因转移具有抵抗作用。鲍曼不动杆菌1-Fb型CRISPR-Cas系统中的cas1可能与耐药性及生物膜形成相关。为筛查鲍曼不动杆菌临床分离株中的CRISPR-Cas系统,我们首先通过CRISPR数据库查找已公布的鲍曼不动杆菌CRISPR-Cas系统,使用NCBI数据库对CRISPR簇的基因序列进行BLAST同源分析并设计PCR引物,然后对67株临床分离株和ATCC19606株进行PCR扩增,扩增产物进行测序分析。对获得的CRISPR-Cas系统的间隔序列进行同源性比对以获取其靶基因的信息。结果显示,目前已公布了 10株携带CRISPR-Cas系统的鲍曼不动杆菌,共含有CRISPR簇12个,cas1、cas3和csy4基因序列各2种,csy1、csy2、和csy3基因序列各1种。分析CRISPR簇上游100 bp DNA的同源性获得2组序列,据此设计了 2条通用正向引物。而CRISPR簇下游100 bp DNA的同源性较低,合并相同序列后设计了 6条不同的反向引物。正反向引物组合对67株临床分离株和ATCC19606株进行CRISPR簇的PCR筛选,在其中2株(AB43与ATCC19606)中筛选到CRISPR簇各1个,AB43株的CRISPR簇长6339 bp,含103间区;ATCC19606株的CRISPR簇长1702 bp,含26间区。对各种cas基因序列分别设计了引物,用PCR方法在AB43株中筛查到cas1、as3、csy2、csy3、csy4等5个cas基因,在ATCC19606株中筛查到cas1、cas3、csy4等3个cas基因。考虑到PCR只能筛选出已知序列的DNA片段,为避免遗漏,对AB43株进行了基因组测序,结果发现其携带的csy1基因。这2株鲍曼不动杆菌CRISPR-Cas系统的间区靶向的基因较多,包括:Ⅳ型分泌蛋白Virb5、带状粘附毒素蛋白、噬菌体蛋白、DNA聚合酶等。Ⅳ型分泌蛋白Virb5是菌毛形成所必须的分泌蛋白,带状粘附毒素蛋白可调控菌毛形成相关基因。提示鲍曼不动杆菌CRISPR-Cas系统可抑制Virb5、带状粘附毒素蛋白基因的表达,可能对生物膜形成具有一定调控作用。三、鲍曼不动杆菌突变株AB43△cas1::Kanr的构建及生物学特性检测为探究鲍曼不动杆菌CRISPR-Cas系统对耐药性及毒力的调控作用,本研究使用RecAb系统的一步敲除法构建了鲍曼不动杆菌突变株AB43△cas1::Kanr,检测突变株的耐药性、血清抗性、生物膜形成能力、生长情况、感染小鼠存活率等的变化。用纸片扩散法检测突变株对8类15种抗生素的耐药性;用血清抗性试验检测突变株在正常人血清与灭活血清中的存活情况;用0.5%结晶紫染色法检测检测突变株的生物膜形成能力;用紫外分光光度仪检测突变株的生长情况并绘制了曲线;采用小鼠气管插管法构建鲍曼不动杆菌感染小鼠肺炎模型,检测突变株的体内毒力。结果显示,AB43野生株对15种抗生素均敏感,而突变株只对加替沙星1种抗生素敏感,对其他14种抗生素均产生了抗性;野生株与突变株的血清抗性无统计学差异;突变株生物膜形成能力较野生株强,生长速度略快;突变株感染小鼠的死亡率较野生株低。上述结果提示鲍曼不动杆菌AB43株的CRISPR-Cas系统在体外可以抑制耐药性、生物膜形成能力和生长速度,而在体内感染时却可以促进细菌的致病性提高小鼠的致死率。