论文部分内容阅读
角膜病在世界致盲性眼病中仅次于白内障，是导致眼盲的第二大原因。角膜感染、角膜外伤、自身免疫系统疾病等因素均可导致角膜病。通过积极有效的治疗，早期角膜病还有治愈的可能，而晚期角膜病最终会导致角膜盲。世界上超过4000万人因角膜病而致盲。目前，角膜移植手术是治疗角膜盲患者最有为效的方法，但需求增加和供体来源缺乏是使角膜移植应用受到很大限制。近年来，角膜组织工程的兴起为组织工程人角膜和组织工程人角膜基质的体外重建以及患者通过临床角膜移植重建光明带来了新的希望。在运用组织工程技术构建组织工程角膜时，支架材料的选择成了制约组织工程角膜构建的重要环节。目前，用于构建组织工程角膜的支架材料主要有胶原、异种角膜基质、壳聚糖等天然材料，此外，还包括一些人工合成材料和复合材料等。胶原是细胞外基质的主要成分，不同生物胶原生物理化性质相似。与其他组织工程支架材料相比，胶原在可降解性、免疫原性、安全性、生物相容性等方面具有比较明显的优势。本文利用人I型、V型胶原蛋白、纤连蛋白以及硫酸软骨素等为主要原料，制备胶原蛋白复合支架。通过优化调整I型胶原的浓度，对胶原蛋白复合支架的制备工艺进行研究。同时，综合对比胶原蛋白复合支架的鉴定结果，将本实验室建立的人角膜基质细胞系细胞接种于最优胶原蛋白复合支架上共培养，通过检测人角膜基质细胞中生长、增殖、分化相关因子的表达情况，检测胶原蛋白复合支架的生物相容性。本文以人I型、V型胶原蛋白、纤连蛋白以及硫酸软骨素等为主要原料，以EDC/NHS（1-[3-二甲基氨基丙基]-3-乙基碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺）为交联剂，运用冷冻干燥法制备不同浓度的胶原蛋白复合支架。对I型胶原浓度分别为9mg/mL、10mg/mL和11mg/mL的胶原蛋白复合支架进行透光性检测、含水量测定和结构检测。结果显示：随着胶原浓度的升高，胶原蛋白复合支架的透明度有所升高、含水量有所降低，但整体变化不大。结构检测结果表明，随着胶原浓度的升高，支架材料超微结构近似；组织结构致密性增加，孔隙的连续性降低。I型胶原浓度为9mg/mL的胶原蛋白复合支架，孔隙连续性较好，但组织结构过于疏松。I型胶原浓度为11mg/mL的胶原蛋白复合支架，组织结构最致密，但孔隙连续性较差。I型胶原浓度为10mg/mL的胶原蛋白复合支架组织结构相对致密，内部孔隙连续性较好，利于细胞的迁入。因此，将I型胶原浓度为10mg/mL的胶原蛋白复合支架用于支架材料的生物相容性鉴定。将本实验室建立的人角膜基质细胞系的第20代人角膜基质细胞进行体外培养和鉴定。结果表明，人角膜基质细胞生长状态良好，增殖旺盛；标志蛋白（波形蛋白）以及功能蛋白（整联蛋白β1、间隙连接蛋白-43、乙醛脱氢酶3A1）呈阳性表达；实时荧光定量PCR结果表明，人角膜基质细胞生长相关因子（mTOR和Kras；Stat3，RRN3）和增殖相关因子（CDK2；p27）都有不同程度的表达。说明人角膜基质细胞能进行正常的生长、增殖，且具有与在体人角膜基质细胞相似的形态、结构和功能，可用于胶原蛋白复合支架生物相容性的检测。以I型胶原浓度为10mg/mL的胶原蛋白复合支架为载体支架进行接种人角膜基质细胞，使用含15%胎牛血清的DMEM/F12（1:1）培养液，于37℃、5%CO2的条件下培养。接种1d、3d和7d的DiI荧光、HE染色结果显示，随着时间推移，人角膜基质细胞向支架内部迁入生长、且均匀分布。扫描电镜和透射电镜结果显示，接种于支架上的人角膜基质细胞形态伸展，且细胞之间以及细胞与支架之间形成一定的连接。实时荧光定量PCR结果表明，人角膜基质细胞接种于胶原蛋白复合支架后，生长相关因子（mTOR和Kras；Stat3，RRN3）和增殖相关因子（CDK2；p27）的相对表达量与接种前近似。以上结果表明，制备的胶原蛋白复合支架与人角膜基质细胞的具有良好的生物相容性。综上所述，本文应用不同组方制备不同浓度胶原蛋白复合支架，并对制备支架进行理化性能鉴定。结果表明，I型胶原浓度为10mg/mL的胶原蛋白复合支架具有较理想的理化性能。生物相容性检测进一步表明，I型胶原浓度为10mg/mL的胶原蛋白复合支架与人角膜基质细胞具有良好的生物相容性，为体外重建组织工程人角膜基质奠定了基础。