近几十年来,越来越多的研究发现RNA非编码基因片段具有应用在诊断和治疗重大疾病方面潜在的商业价值。非编码基因片段包括非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)和编码蛋白mRNA的非编码区段(untranslated region,UTR)。非编码RNA是所有不编码蛋白质的RNA转录本的统称,其代表是微小RNA(microRNA,miRNA)和长非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)。在可编码蛋白mRNA上存在的非编码区段代表是核糖开关(riboswitch)。微小RNA是一类长度介于18~25个核苷酸的非编码RNA,研究表明人类编码蛋白的基因中约30%受到miRNAs调控。它们参与基因的表达及调控、RNA加工及剪切和蛋白质翻译等生物学过程,强烈调控着生物的生长和发育。长非编码RNA是一类长度大于二百个核苷酸的非编码RNA,它们参与基因的表达及调控、RNA加工及编辑、蛋白质翻译、印迹调控和端粒系统的调控等,同时其自身还可形成核酶或核糖开关。核糖开关是一类能够通过与代谢物小分子结合引起构象变化而调控下游基因表达的mRNA分子。核糖开关在细菌中有着广泛的分布,同时调控细菌体内很多重要基因的表达过程,调控细菌的基本生命代谢和信号传导。通常对于生物大分子结构和功能的研究都是运用结构生物学的方法达成。以rna为例,其主要研究步骤包括:目的rna获得与纯化、rna结晶、衍射和相角数据的收集及处理修正,最后是结构的描述和功能关系的研究。从上述步骤可以看出,如何获得转录量大、纯度高的目的rna是所有结构与功能研究的基础。目前,有关运用rna聚合酶体外转录生成rna时有报道。但是,有关用于非编码类rna结晶的体外转录却鲜有报道,特别是对晶体结构模板体外转录的优化实验更是未见报道。本文的立意点和创新点即在于选择sam-v核糖开关晶体结构模板作为代表物,参考doudna等报道的体外转录体系,对相关的反应条件进行优化,得到一个较优的用于非编码类rna结晶的体外转录体系,从而提高目的rna体外转录的效率。选择的优化条件包括反应时间、ntps添加浓度和镁离子添加浓度等几个方面。每次只改变一个因素,初步设计实验条件,对所得实验结果用聚丙烯酰胺凝胶检测,并使用bio-rad仪器对凝胶进行拍照和分析,在相同背景下对所得条带的rna浓度进行估算,得到目的rna相对百分含量,绘得其变化趋势图。其中有关反应时间的结果表明,目的rna相对百分含量随着反应时间的延长不断提高,在8h时达到最高值,对比标准对照体系目的rna产率提高了50%;ntps添加浓度的结果表明,目的rna相对百分含量随着ntps添加浓度的提高而不断提高,在添加浓度为4mm/l时达到最高值,对比标准对照体系目的rna产率提高了50%;镁离子浓度的结果表明,目的RNA相对百分含量随着Mg2+添加浓度的提高而不断提高,在Mg2+添加浓度为85mM/L时达到最高值,对比标准对照体系目的RNA产率提高了将近80%。最后,将上述单项最优条件组合成为RNA体外转录优化体系,与标准体系一起进行体外转录实验,比较两种体系生成目的RNA百分含量。结果显示,优化体系转录生成的目的RNA百分含量较标准对照体系提高了将近100%。