嗜水气单胞菌不同分离株外膜蛋白图谱分析及其与耐药性的关系

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嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)普遍存在于淡水、土壤、人畜粪便等各种环境中,可引起多种水产动物的败血症以及畜禽和人类腹泻。嗜水气单胞菌是重要的水生病原菌,给水产养殖业造成极大的经济损失,由于抗生素在渔业方面的滥用,导致嗜水气单胞菌产生耐药性,对水产养殖业的进一步发展产生影响.外膜蛋白作为革兰氏阴性菌外膜的重要结构对细菌耐药性的形成有一定的影响.对43株嗜水气单胞菌的外膜蛋白(OMP)进行SDS-PAGE分析,根据不同菌株蛋白质电泳条带之间的差异性可以将其分成多个型:OMP I-OMPⅥ.使用统计软件SPSS13.0进行聚类分析,以期在流行病学调查方面提供进一步了解。采用微量双倍稀释法测定43株嗜水气单胞菌最小抑菌浓度。药敏试验结果参照美国NCCLS标准判定各菌株是否耐药。在所选的7种抗生素中,环丙沙星、恩诺沙星、氟苯尼考对临床分离的43株嗜水气单胞菌的作用较好,抑菌率分别达97.67%(42/43)、97.67%(42/43)和95.35%(41/43),而其它几种抗生素的抑菌效果较差,红霉素、泰乐菌素,抑菌率只有9.30%(4/43)、6.98%(3/43),所有43株菌株对氨苄西林和磺胺间甲基嘧啶则完全耐药。多数菌株具有多重耐药性,两个与多重耐药输出泵相关的基因AHA0858和aheABC在嗜水气单胞菌各菌株中广泛分布,检出率分别为77%(33/43)和81%(35/43)。实验中发现嗜水气单胞菌的外膜蛋白电泳图谱与细菌的耐药性有一定的关系,外膜蛋白型相同的菌株在耐药性也基本一致.同其他菌株相比,菌株NB-1,A.Pun和MR-1于30kD~45kD处部分外膜蛋白条带缺失,并且其对氟苯尼考(florfenicol)耐药性也大幅增强,提示部分外膜蛋白的缺失可能与嗜水气单胞菌的耐氟苯尼考有一定的关系.同时发现部分具有完全一致OMP型的菌株在某些抗生素的耐药性上也存在差异,表明嗜水气单胞菌的耐药性有其他因素影响.为了对嗜水气单胞菌的耐药机理进行更进一步的研究,本实验通过对嗜水气单胞菌J-1株(诺氟沙星敏感株)利用半数最小抑菌浓度的方法诱变形成稳定的诺氟沙星耐药株,出发菌株J-1对诺氟沙星的最小抑菌浓度为0.78μg/mL,诱变后形成的诺氟沙星耐药菌株NJ-1最小抑菌浓度为90μg/mL.利用比较蛋白质组学的方法对嗜水气单胞菌J-1和诺氟沙星耐药诱变株NJ-1进行二维电泳的研究,软件分析比较两者的蛋白质电泳图谱的差异蛋白点。通过双向电泳、质谱测定肽质量指纹图谱,鉴定出嗜水气单胞菌外膜蛋白中4个与嗜水气单胞菌诺氟沙星耐药性形成相关的蛋白,包括寡聚ABC转运器蛋白、玻璃酸酶蛋白、OmpAⅡ和二氢吡啶二羧酸合酶。细菌对诺氟沙星耐药性的形成可能与细菌外膜通透性改变从而减少抗生素的摄入以及产生灭活酶或钝化酶修饰抗生素有关.本研究为进一步揭示嗜水气单胞菌外膜蛋白与耐药性相关性提供了理论依据.
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