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骨骼的形成方式主要有两种方式：软骨内成骨和膜内成骨。其中软骨内成骨是除顶骨、额骨、锁骨和部分上、下颌骨之外所有骨骼,包括躯干骨和四肢骨的主要的形成方式[1,2]。软骨内成骨是由软骨细胞的增殖、分化和凋亡,间充质干细胞、前成骨细胞和破骨细胞等细胞共同参与的一个复杂过程[3]。在这个过程中,参加软骨内成骨的细胞的增殖、分化是由一系列分子调控机制,如细胞生长因子、激素以及细胞外基质等[4,5,6]。甲状旁腺激素(Parathyroid Hormone, PTH)是体内钙、磷调节和调节骨生长发育及骨质吸收、重建的一个重要调节因子。现有的研究表明,PTH对骨质代谢的调节根据不同的作用方式,可产生促进或抑制骨形成的双重作用[7,8,9]。本研究通过下述三部分,应用免疫组化、细胞增殖检测实验、ALP活性检测、茜素红染色、Western blot、Real-time PCR等实验方法,研究了间歇性和持续型性给予PTH对髁突软骨细胞、骨髓基质干细胞及共培养的两种细胞的增殖、分化等方面的影响。第一部分PTH对髁突软骨细胞增殖、分化的影响目的：研究PTH在持续性或间歇性作用方式下对大鼠髁突软骨细胞增殖、肥大分化的影响。方法：分离新生24h内雌性大鼠的髁突软骨组织,通过Ⅱ型胶原酶酶消化法获取原代的大鼠髁突软骨细胞,体外培养所获取的髁突软骨细胞至80%融合时,根据PTH的作用方式,分为三组：PTH持续应用组,PTH间歇应用组,空白对照组。PTH持续应用组：每48h的前6h加入含10nM PTH的矿化培养基,6h后更换为仍含10nM PTH的矿化培养基,直至48h：PTH间歇应用组：每48h的前6h加入含1OnM PTH的矿化培养基,6h后更换为不含PTH的矿化培养基,直至48h;空白对照组：每48h的前6h及6h后的培养基均不含PTH。通过MTT试验检测不同的PTH刺激方式对髁突软骨细胞增殖活性的影响；茜素红染色检测培养6天和14天后各组细胞矿化结节的形成情况；提取各组成骨诱导培养2天、6天和14天后的细胞总RNA或者总蛋白,用碱性磷酸酶检测试剂盒检测碱性磷酸酶活性,应用Western blot和Real-time PCR检测软骨细胞增殖、分化及骨质形成相关蛋白和基因mRNA的表达水平,包括RUNX2、BSP、BMP2、COL2a1、 COL10al、OCN、COL1a1及OSX。结果：PTH持续应用组髁突软骨细胞的增殖能力明显高于PTH间歇应用组和空白对照组(P<0.05)；空白对照组的髁突软骨细胞增殖能力明显高于PTH间歇性应用组(P<0.05)。茜素红染色结果表明,PTH间歇性应用组软骨细胞形成矿化结节的数量最多,而PTH持续性应用组形成的矿化结节数量最少。6天时,PTH间歇应用组和空白对照组的ALP活性明显高于PTH持续应用组(P<0.05),PTH间歇应用组的ALP活性略高于空白对照组,但两者间无统计学差异；14天时,PTH司歇应用组的ALP活性远高于PTH持续应用组和空白对照组(P<0.05),PTH持续应用组的ALP活性明显低于空白对照组(P<0.05)。Western blot结果显示,PTH间歇应用组的RUNX2、BSP和BMP2蛋白表达量明显高于PTH持续应用组和空白对照组(P<0.05); PTH持续应用组的RUNX2和BSP蛋白表达量明显低于空白对照组(P<0.05); PTH持续应用组的BMP2蛋白表达量明显高于空白对照组(P<0.05)。6天时,PTH持续应用组的COL2al mRNA表达量明显高于PTH间歇应用组(P<0.05),而PTH间歇应用组的COL10al mRNA表达量明显高于PTH持续应用组(P<0.05);PTH间歇应用组的RUNX2和ALP表达量明显高于PTH持续应用组(P<0.05);2天和/或6天时,骨质形成相关的OCN、BMP2、COL1al和OSX mRNA在PTH间歇应用组的表达量均明显高于PTH持续应用组(P<0.05)。结论：持续性应用PTH促进髁突软骨细胞的增殖,同时抑制其成熟分化；间歇性应用PTH促进髁突软骨细胞的肥大分化及骨质形成,而抑制其增殖。第二部分PTH对骨髓基质干细胞增殖、分化的影响目的：研究PTH在持续性或间歇性作用方式下对大鼠骨髓基质干细胞(Bone Marrow Stromal Cells, BMSCs)增殖、成骨向分化的影响。方法：无菌条件下取大鼠股骨和胫骨,通过全骨髓培养的方法获取原代大鼠BMSCs,传代培养至第二代,根据PTH应用方式不同分为三组：PTH持续应用组,PTH间歇应用组,空白对照组(同第一部分)。通过MTT实验检测不同的PTH刺激方式对BMSCs增殖活性的影响;茜素红染色检测培养14天后各组细胞矿化结节的形成情况；提取各组成骨诱导培养2天、6天和14天后的细胞总mRNA或者总蛋白,用碱性磷酸酶检测试剂盒检测碱性磷酸酶活性,应用Real-time PCR检测BMSCs成骨向分化及骨形成相关基因mRNA,包括RUNX2. ALP、BMP2、OCN、COLla1、OSX及抑制骨形成基因SOST的mRNA表达情况。结果：PTH持续应用组BMSCs的增殖能力较PTH间歇应用组和空白对照组BMSCs的增殖能力明显高(P<0.05); PTH间歇应用组BMSCs的增殖能力较空白对照组高,但两者之间未见明显统计学差异。PTH司歇应用组形成的矿化结节数量及大小均高于PTH持续应用组和空白对照组；PTH持续应用组形成的矿化结节数量和大小均最少。PTH间歇应用组BMSCs的ALP活性明显高于PTH持续应用组和空白对照组(P<0.05);在6天和14天时,PTH持续应用组ALP活性明显低于空白对照组(P<0.05)。PTH间歇应用组的BMSCs成骨向分化标志物RUNX2和ALP的mRNA表达量均明显高于PTH持续应用组(P<0.05);骨形成相关的COLla1、BMP2、OCN、OSX在PTH间歇应用组2天和/或6天的表达量高于PTH持续应用组(P<0.05)；成骨抑制基因SOST的mRNA在PTH持续应用组表达明显高于PTH间歇应用组和空白对照组(P<0.05)。结论：持续性应用PTH促进大鼠BMSCs的增殖,并抑制其成骨向分化；间歇性应用PTH明显促进BMSCs的成骨向分化及骨质形成,但对BMSCs的增殖未见明显抑制。第三部分PTH对共培养的髁突软骨细胞和BMSCs成骨分化和骨质形成的影响目的：研究PTH在持续性或间歇性作用方式下对共培养的髁突软骨细胞和BMSCs分化和骨质形成的影响。方法：将获取的原代髁突软骨细胞和第二代BMSCs按照1：1的比例混合后共培养,培养至80%融合时开始PTH刺激,根据PTH应用方式不同分为三组：PTH持续应用组,PTH间歇应用组,空白对照组(同第一部分)。茜素红染色检测培养6天和14天后各组细胞矿化结节的形成情况；提取各组成骨诱导培养2天、6天和14天后的细胞总mRNA或者总蛋白,用碱性磷酸酶检测试剂盒检测碱性磷酸酶活性,应用Western blot和Real-time PCR检测BMSCs成骨向分化及骨形成相关蛋白和基因mRNA,包括COL2a1、COL10al、RUNX2、BSP、MMP13、 ALP、OCN、OSX及抑制骨形成基因SOST的mRNA表达情况。结果：PTH间歇应用组在6天和14天时形成的矿化结节数量最多,而PTH持续性应用组形成的矿化结节在三组中数量最少。经过6天和14天的PTH作用,PTH间歇应用组的ALP活性明显高于PTH持续应用组和空白对照组(P<0.05),PTH持续应用组的ALP活性明显低于空白对照组(P<0.05)。Western blot结果显示PTH间歇应用组的RUNX2.BSP和MMP13的蛋白表达量明显高于PTH持续应用组和空白对照组(P<0.05)：PTH持续应用组的RUNX2、BSP和MMP13蛋白表达量明显低于空白对照组(P<0.05)。PTH持续应用组COL2al mRNA的表达量明显高于PTH间歇应用组(P<0.05),而PTH持续应用组COL10al mRNA的表达量明显低于PTH间歇应用组(P<0.05)：成骨分化标志物RUNX2、ALP和骨形成相关基因OCN、OSX在PTH间歇应用组的表达量明显高于PTH持续应用组(P<0.05)；成骨抑制基因SOST mRNA在PTH持续应用组表达明显高于PTH间歇应用组和空白对照组(P<0.05)。结论：髁突软骨细胞和BMSCs共培养可模拟体外软骨内成骨过程：间歇性应用PTH明显促进共培养体系的成骨向分化及骨质形成,即促进体外模拟软骨内成骨过程,而持续性应用PTH则抑制该过程。