胰腺癌(PC)是一种起病隐匿且恶性程度极高的肿瘤,生存率低至5%,约占全球癌症相关死亡的4.5%。预计到2030年,它将成为癌症相关死亡的主要原因之一,仅次于肺癌。根据临床统计数据表明,约77%的PC患者将在确诊后一年内死亡,95%的患者将在5年内死亡。大量研究表明,microRNA(miRNA)在多种癌症患者的血清中异常表达,或高或低,因此可将其作为新型肿瘤生物标志物。高效地检测血清中的miRNA,不仅可以对胰腺癌进行早期诊断,提高患者生存率,而且为判断胰腺癌的发展进程与预后状态提供可靠的依据。本研究通过查阅大量文献,搜集并整理出已被证实在胰腺癌中稳定存在且异常表达的miRNA。利用胰腺癌细胞株Sw1990对初筛的30个miRNA进行表达水平验证,从中筛选出符合要求的4个miRNA作为后续检测的目的基因,它们分别为miR-24-1-5p*、miR-181a-5p、miR-10b-5p和miR-132-3p。本论文的实验核心主要分为优化血清提取miRNA技术和建立多重荧光定量PCR(mRT-qPCR)体系两个部分。首先是从三种常用的miRNA提取试剂中筛选出综合效率最好的,即TRIzol LS,并优化其提取过程,最终确定了提取方案;其次,我们分别对影响多重RT-qPCR扩增效率的多个因素进行条件探索优化,最终确定反转录过程中,每15μL反应体系中,RNA的上样量为50ng为最佳,dNTP混液用量为0.15μL,Multiscribe RT enzyme用量为1.0μL;在PCR扩增过程中,每20μL体系中,dNTPs混液用量为2.5μL,引物与探针的加入量为2.0μL;最后,优化四种目的miRNA的Taqman探针序列。最终实现了多重荧光定量PCR的构建。