背景与目的脊髓损伤是一种常见的中枢神经系统损伤,可造成患者的感觉、运动等功能严重障碍,给自身、家庭和国家带来沉重的经济、社会负担。虽然大量基础实验研究对动物脊髓损伤的治疗取得了令人鼓舞的结果,但是临床治疗脊髓损伤的效果始终不令人满意。因此,积极开展脊髓损伤的治疗研究有着重要的科学和社会意义。随着研究的深入人们认识到轴突脱髓鞘改变是临床和实验脊髓损伤的重要病理变化。外力作用脊髓后通常在软脊膜下存留部分相对正常的白质区域,多种继发性损伤因素的影响进一步造成了残留神经纤维的脱髓鞘改变。研究表明脊髓损伤后轴突脱髓鞘改变与损伤局部少突胶质细胞死亡有着密切的联系。脊髓损伤不仅造成神经元的丢失,同时还导致少突胶质细胞大量的死亡进而引起神经轴突脱髓鞘改变。正常的髓鞘及髓鞘形成细胞对于神经轴突的功能发挥有着重要作用,因而脊髓损伤后少突胶质细胞死亡和轴突脱髓鞘改变进一步影响了残留神经纤维功能的正常发挥。上述研究分析表明,脊髓损后由于继发性损害和少突胶质细胞死亡而造成残留脊髓组织内轴突脱髓鞘改变,影响了存留神经纤维的功能发挥。因此,我们推测改善脊髓损伤后轴突髓鞘化可有助于损伤脊髓神经功能的恢复。由于少突胶质细胞死亡是造成损伤脊髓轴突脱髓鞘改变的主要原因,因而补充丢失的少突胶质细胞、改善残留神经轴突髓鞘化,有利于脱髓鞘神经轴突的功能恢复、最大限度地发挥残留神经纤维的作用,从而促进损伤脊髓神经功能的恢复。少突胶质前体细胞(Oligodendrocyte Precursor Cells,OPCs)是未成熟的少突胶质细胞,能够在体内增殖、迁移、最后分化为成熟少突胶质细胞并形成髓鞘发挥功能。OPCs作为移植细胞比成熟少突胶质细胞更具有优势,也不像干细胞那样容易受到移植微环境的不利影响。基于以上分析,本实验拟通过OPCs移植治疗改善损伤脊髓轴突髓鞘化,发挥残留神经纤维的功能,进而实现促进脊髓神经功能恢复的目的。通过本课题研究进一步加深对脊髓损伤轴突脱髓鞘改变生物学意义的认识,并为今后脊髓损伤治疗研究提供一种新的思路。方法1.取新生48小时Sprague-Dawley大鼠大脑皮层细胞进行OPCs原代培养,通过相差显微镜和扫描电子显微镜连续观察体外条件下OPCs的生长情况。2.实验采用振荡分离和差速贴壁等方法进一步分离OPCs,通过免疫细胞化学技术对分离后的OPCs进行分析鉴定。3. OPCs在体外化学条件培养基中继续生长,通过相差显微镜连续观察和免疫细胞化学技术检测研究分析体外条件下OPCs的定向分化规律和分化成熟情况,并采用MTT检测法研究分析OPCs在体外条件下的分裂增殖能力。4.采用Allen’s打击法制作大鼠脊髓挫裂损伤模型,将实验大鼠分为四组,即OPCs移植治疗组、移植对照组、单纯损伤组及假手术组。在脊髓损伤术后第7天时将体外标记的OPCs移植治疗大鼠脊髓损伤。5.通过BBB运动功能评分法连续评估脊髓损伤后大鼠后肢运动功能的恢复情况,并采用神经电生理技术检测分析OPCs移植治疗对大鼠损伤脊髓神经传导功能恢复的影响。6. OPCs移植治疗术后8周时实验观察比较了各组大鼠损伤脊髓组织的大体病理变化情况,研究分析了OPCs移植治疗对大鼠损伤脊髓局部组织内白质存留的影响;实验采用免疫组织化学及免疫荧光技术检测分析了移植后OPCs在体内的存活、分布及分化成熟等情况;通过免疫组织化学、髓鞘染色、RT-PCR及透射电镜技术等方法研究分析了OPCs移植治疗对大鼠损伤脊髓组织内髓鞘含量、髓鞘相关基因表达及轴突髓鞘化超微结构的影响;实验还观察研究了OPCs移植治疗对大鼠损伤脊髓内神经元、神经轴突和胶质反应的影响。结果1.原代培养中OPCs大量增殖生长呈典型的前体细胞形态,镜下见其胞体呈近圆形,为折光性强的小亮点,胞体具有双极细胞突起。扫描电子显微镜观察见OPCs紧密贴附在星形胶质细胞表面生长,胞体较小呈近似圆形,直径约6-10μm,胞体周围具有纤细的两极或三极细胞突起。2.原代培养第9-10天时形成明显的细胞分层,上层为成簇生长的OPCs,下层为融合成片的星形胶质细胞。通过振荡分离和差速贴壁等方法分离获得了大量的OPCs,免疫细胞化学检测结果显示分离后特异性表达PDGFR-α的OPCs比例达95 %。3. OPCs能够在体外化学条件培养基内继续生长分化,胞体不断增大,细胞突起逐渐增多、增长并形成大量分支。在体外培养5-7天时OPCs逐渐定向分化为成熟的少突胶质细胞,镜下见其胞体呈圆形,胞体周围具有大量网状纤细突起,呈“分枝”状或“蜘蛛网”状分布于胞体四周。免疫细胞化学技术检测分析显示分化成熟的少突胶质细胞特异性表达主要髓鞘结构蛋白MBP。4.实验研究表明OPCs在体外培养条件下仍保持着良好的分裂增殖能力,MTT检测结果显示观察期内OPCs的细胞数量不断增加(p < 0.05),实验观察初期OPCs的数量最少,在观察后期OPCs的数量逐渐增加,于第6天时细胞数量达到最多。5. OPCs移植治疗组大鼠后肢运动功能的恢复情况明显好于移植对照组和单纯损伤组。脊髓损伤术后第35、42、49天时OPCs移植治疗组大鼠后肢运动功能的BBB评分情况比移植对照组结果更好(p < 0.05);第56和63天时OPCs移植治疗组大鼠的后肢运动功能BBB评分结果明显好于移植对照组(p < 0.01)。6.神经电生理检测结果表明OPCs移植治疗组大鼠损伤脊髓神经传导功能的恢复亦明显好于移植对照组和单纯损伤组。移植治疗术后第4周时OPCs移植治疗组大鼠MEPs N1波峰潜时和波幅的结果要优于移植对照组(p < 0.05);移植治疗术后第8周时OPCs移植治疗组大鼠MEPs N1波峰潜时和幅度的恢复情况均显著好于移植对照组(p < 0.01)。移植治疗术后第2和4周时OPCs移植治疗组大鼠SSEPs N1波波幅的恢复情况也较移植对照组更好(p < 0.05);移植治疗术后第8周时OPCs移植治疗组大鼠SSEPs N1波峰潜时和波幅的结果也均明显优于移植对照组(p < 0.01)。7.移植治疗术后第8周时研究结果显示OPCs移植治疗组大鼠损伤脊髓局部组织内存留的白质较移植对照组和单纯损伤组明显更多(p < 0.05);OPCs移植治疗组大鼠损伤脊髓局部组织内可检测到BrdU阳性的移植细胞存活,移植的OPCs在大鼠损伤脊髓组织内广泛分布并与宿主组织良好整合;移植的OPCs能够在体内继续分化成熟并表达MBP;OPCs移植治疗组大鼠损伤脊髓组织内Oligo2阳性的少突胶质细胞明显多于移植对照组(p < 0.01)。8. OPCs移植治疗组大鼠损伤脊髓组织内MBP的表达量明显多于移植对照组(p < 0.01),LFB髓鞘染色结果也表明OPCs移植治疗组大鼠脊髓组织内髓鞘的含量亦显著高于移植对照组(p < 0.01);OPCs移植治疗组大鼠损伤脊髓组织内PLP基因的表达水平较移植对照组明显增高(p < 0.01)。9.透射电镜观察结果显示OPCs移植治疗组大鼠损伤脊髓组织内轴突髓鞘化有明显的改善。移植对照组大鼠损伤脊髓组织内存在大量脱髓鞘、肿胀退变的神经轴突,结构解离、髓鞘崩解。OPCs移植治疗组大鼠脊髓组织内脱髓鞘的退变神经轴突更少,其髓鞘结构亦更接近于正常。10. OPCs移植治疗组大鼠损伤脊髓组织内β-TubulinШ阳性的神经元和NF200阳性的神经轴突均明显多于移植对照组(p < 0.01)。OPCs移植治疗组大鼠损伤脊髓组织局部内GFAP表达量和星形胶质细胞数量均明显低于移植对照组(p < 0.05)。结论1.本实验建立了OPCs体外培养体系,通过适时的原代培养、恰当的振荡分离及差速贴壁等方法处理能够有效地分离获得OPCs。2.研究结果表明分离后OPCs能够在体外条件下继续存活生长,保持着良好的分裂增殖能力,并且能够在体外定向分化为成熟的少突胶质细胞。3. OPCs移植治疗能够促进脊髓损伤后大鼠后肢运动功能和脊髓神经传导功能的恢复。4.移植术后OPCs能够在损伤脊髓内长期存活、分化成熟,与宿主组织良好的整合,并补充损伤脊髓组织内的少突胶质细胞。5. OPCs移植治疗大鼠脊髓损伤有利于损伤脊髓组织内白质存留,改善损伤脊髓轴突髓鞘化,促进损伤脊髓组织内神经元和轴突存活及减轻胶质反应。