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基因定点诱变(site-directed mutagenesis，SDM)技术是遗传学研究中最重要的手段之一，是分子生物学常用的基因操作方法，被广泛运用于研究基因的生物学特性，探索蛋白质的结构和功能等。随着基因组测序计划的完成，定点诱变技术将会在功能基因组学中扮演重要角色，并促进蛋白质组学的发展。PCR 技术的发展丰富了定点诱变方法的内容，使得制备突变体更简单容易。而 DNA 重组工程的发展使得在大肠杆菌体内对染色体 DNA、对 BAC 和 PAC 质粒或普通质粒载体进行精确的修饰成为可能。
本研究首先是在本实验室已成功的无酶克隆技术的基础上，综合利用了大肠杆菌中不依赖于 RecA 的同源重组和体内DpnI消化甲基化模板的可行性，对目前的PCR的定点诱变技术进行了大的改进。其次是尝试利用λRed/ET重组系统和细菌辅助交配遗传整合型克隆方法 (mating-assisted genetic integrated cloning，MAGIC)对大肠杆菌的染色体DNA的靶向修饰。
第一阶段的研究主要是：首先，为了解决反向PCR诱变方法中PCR产物的自环化问题，我们充分利用大肠杆菌中不依赖RecA的同源重组优化了PCR的引物设计，在引物的5‘端重叠约15bp，扩增后使PCR产物的末端带有约1.5bp的同源区，转化大肠杆菌细胞实现了PCR产物在细菌体内的自环化。其次，为了省去体外 DpnI消化模板质粒以提高突变效率的步骤，我们利用PCR的方法体外合成了一个表达DpnI的基因，并对其功能进行了验证，然后将这个基因克隆在一个诱导型的温敏型质粒载体上，得到表达DpnI的质粒pU-Z-dpnC-His<,(6)>，这个质粒转化本研究构建的一个 DNA 腺嘌呤甲基化酶缺陷的大肠杆菌菌株Escherichia coliBUN21M，得到一个在阿拉伯糖诱导下表达DpnI的菌株 E．coliBUNDpnI．
第二阶段的研究主要是：针对第一阶段的引物设计方案及得到的表达DpnI的菌株E．coli BUNDpnI，选取了实验室现有的质粒模板pSK-thyA，pMD-18-T，pBluescript．IISK做了一系列的缺失，插入和点突变实验，数据证明新的PCR突变系统的是简单有效的(>90％)。
本研究进行的过程中尝试了 MAGIC (mating-assisted genetic integratedcloning) 的方式对细菌 (E．coli BUN21，E．coli DH10B， Ecoli DH5 α)染色体的dam基因进行打靶，成功地构建一系列DNA腺嘌呤甲基化酶缺陷的重组菌株，E.coli BUN21M，E.coli DH10BM，E.coli DH5 α M。另外我们还准备尝试体外构建温敏型的带有突变的质粒，结合Red重组系统和I-SceI的选择方式，通过转化实现无筛选标记的对细菌染色体DNA的基因打靶。
本研究提供了一种简单有效的基因操作方法，新的基于PCR的体外定点诱变技术在操作上更简单快捷，能够快速高效地获得重组突变体。在引物设计上方便简捷，只需要一对引物(一条普通的PCR引物加上一条稍微长的引物)，PCR扩增得到的产物可以直接转化阿拉伯糖诱导的E．coli BUNDpnI感受态细胞，只需两步操作过程(PCR扩增和转化大肠杆菌感受态细胞)就能得到重组的突变质粒，真正能做到高通量定点诱变，且不需订购特殊修饰的引物，不需PCR后的任何处理步骤(不需要酶切连接，无需任何体外的杂交过程，不需要胶回收和体外DpnI的消化处理)就能方便迅速地构建突变体。而MAGIC的方式对染色体DNA的打靶修饰证明也是非常有效的，与以往的方法相比，在操作上要简单，效率也比电转化的方式要高。将基于PCR的体外突变系统用于构建基因打靶载体，结合MAGIC或其它的基因打靶技术可实现对微生物基因组和BAC化DNA快速而精细的修饰。新的基因定点诱变系统对于充分利用基因组计划的重要资源进行高通量、大规模的基因功能研究和促进蛋白质组学研究的进程有着重要的意义。