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为了研究禽类多瘤病毒(Avian polyomavirus,APV)晚期基因多顺反子翻译起始调控机制,Agno-1a前导蛋白对下游VPs蛋白合成的调控机制的影响作用。设计构建一系列新型cDNA重组病毒,在agno-1a mRNA编码序列的ATG区域,设计插入一个和插入两个含有ATG的最佳翻译起始信号的7个氨基酸in-frame片段。在agno-1a编码mRNA序列的ATG区域,设计PCR点突变,使起始密码子ATG变成ACG或CTG,从而关闭agno-1a的翻译并可能改变关键mRNA二级结构,形成ATG突变型重组克隆。片段插入型克隆:SDS碱裂解法,提取APV cDNA克隆pHL1003质粒DNA,用限制性内切酶Acc I部分酶切,得到回收的载体片段,人工合成的27bp DNA并磷酸化的目的片段,经T4连接酶与载体片段连接,筛选阳性重组质粒,通过测序验证,得到片段插入型cDNA克隆pHL1003+1、pHL1003+2。点突变型克隆:用限制性内切酶Nco I完全酶切和Acc I部分酶切pHL1003质粒DNA,得到载体片段,设计PCR点突变起始密码子ATG变为ACG和CTG的目的片段,与载体片段连接,筛选阳性克隆测序验证。设计构建GFP为下游报告基因荧光标记的APV-1晚期基因真核双顺反子表达载体,以EGFP报告基因替代野生型病毒APV-1编码晚期结构蛋白VPs基因的碱基序列。pHL1003质粒DNA为模板,PCR扩增出与野生型病毒APV-1相同的Ori区、早期编码区和晚期agno-1a区序列,作为载体片段,载体片段黏性末端补齐平末端连接后,得到重组质粒pHL1003-1(可作为Agno-1a蛋白表达质粒)。质粒DNA pEGFP-N1为模板,PCR扩增出编码绿色荧光蛋白的EGFP片段,作为目的片段与上述载体片段经T4连接酶连接,构成重组质粒pHL1003-GFP,测序验证。用限制性内切酶NruI和NedI双酶切pHL1003+1、pHL1003+2和pHL1003-GFP,得到目的片段和载体片段连接,构建pHL1003+1-GFP,pHL1003+2-GFP克隆。通过磷酸钙和脂质体的转染方法,将构建成功的cDNA突变型质粒DNA,分别定量转染到鸡胚和鹌鹑胚胎成纤维细胞中,分别利用Western blot和荧光显微镜观察检验。Western blot结果显示出部分特异性条带,荧光显微镜观察转染72 h后的鸡胚和鹌鹑胚胎成纤维细胞,转染成功胚胎细胞明显表达较强的荧光。结果表明,GFP荧光标记的APV-1真核双顺反子cDNA表达载体在鸡胚和鹌鹑胚胎成纤维细胞中正常表达了GFP蛋白并产生荧光。转染实验过程中,对转染过程的时间,转染质粒DNA的用量和转染过程中培养基pH等方面条件不断优化,提高了转染效率。根据不同质粒DNA组合转染不同染禽类胚胎原代细胞及其荧光表达量的差异的结果分析提示,在APV晚期基因多顺反子上游基因插入额外起始密码ATG会影响下游顺反子的翻译;Agno-1a蛋白对其下游基因翻译起始起重要的正调控作用。