药物性肝损伤（drug-induced liver injury,DILI）是临床上最常见的药物严重不良反应之一。根据国内外流行病学研究,DILI的发病率呈上升趋势,DILI带来的疾病负担不容忽视。研究如何提高DILI的临床诊疗水平具有重要价值。然而,由于缺乏较高特异性和敏感性的生物标志物,目前DILI临床诊断主要是采用排除法的策略,临床准确诊断和评价面临着很大挑战。因此,基于患者血清等临床易于获取的生物标本,寻找DILI相关生物标志物,考察这些潜在生物标志物与DILI的临床表型、组织病理学表型的相关性,进而筛选发现一些能够较好地区分不同发病机理、损伤靶细胞类型、不同病理损伤程度DILI患者的生物标志物及其组合,并在外部验证中心的队列中进行验证,对于辅助提高DILI诊断和治疗具有潜在的临床意义。基于这些具有较好区分诊断能力的生物标志物组合,通过生物学通路富集分析,以期为理解DILI复杂临床表型背后的可能机理提供新的视角,为促进DILI的临床转化医学研究提供参考,是一个值得深入研究的重要方向。本论文的主要研究内容和结果:1.DILI队列的建立和标本采集参考国内外常用的美国胃肠病学院、中华医学会以及中华中医药学会发布的DILI临床诊疗指南的诊断标准,分别建立筛选中心队列（198例）和外部验证中心队列（21例）,共纳入219例符合条件的DILI患者及其血清标本。纳入研究的DILI患者年龄中位数为49.0岁,男女性别比为1:2.4。根据目前诊疗指南的评价标准,纳入队列中的DILI患者的临床分型（R值分型）属于肝细胞损伤型、胆汁淤积型和混合型的例数和构成比,分别为75例（34.2%）、97例（44.3%）和47例（21.5%）;肝损伤严重程度属于轻度（1级）、中度（2级）和重度（3级）的例数和构成比,分别为127例（58.0%）、27例（12.3%）和65例（29.7%）。所纳入的219例DILI患者中,有肝组织穿刺和病理检查结果的共107例,占总纳入病例数的48.8%。其中病理分型为肝细胞损伤型、胆汁淤积型和混合型的例数和构成比,分别为58例（54.2%）、16例（14.9%）和17例（15.9%）,其余未分型16例（14.9%）;肝组织炎症活动程度分级属于G1～G4级的例数和构成比,分别为14例（13.1%）、36例（33.6%）、34例（31.8%）和13例（12.1%）,其余未分级10例（9.3%）;肝组织纤维化程度分期属于S0～S4期的例数和构成比,分别为16例（14.9%）、22例（20.6%）、33例（30.8%）、10例（9.3%）和4例（3.7%）,其余未分期22例（20.6%）。2.基于UPLC-Q-TOF-MS（超高压液相色谱-飞行时间质谱）的DILI血清非靶向代谢组学检测采用UPLC-Q-TOF-MS技术,对所收集的DILI患者血清标本进行检测。方法学考察表明,质量控制（quality control,QC）样本均能很好地聚集,表明样品的制备方法和系统检测方法稳定,符合代谢组学检测和分析的基本要求。从219例DILI患者血清标本的代谢组学检测数据中,共检测到22459个化合物质荷比,与人类代谢组数据库（The Human Metabolome Database,HMDB）检索比对鉴定,共发现了2237个代谢物,大致分为磷脂及鞘脂类（309个,13.8%）、脂肪酸类（161个,7.2%）、固醇类（122个,5.4%）、糖类（45个,2.0%）、肽类及氨基酸类（656个,29.3%）、维生素类（90个,4.0%）、核苷类（59个,2.6%）、泛醌类（25个,1.1%）等。建立了2237个代谢物相对丰度及其组间差异的数据集,为后续多元统计分析和生物标志物筛选提供了数据准备。3.与病理损伤靶细胞类型相关的代谢组学标志物筛查研究目前国内外临床指南中,普遍采用基于血清学酶生化指标的R值分型方法,对DILI进行靶细胞损伤类型的临床分型,即肝细胞损伤型、胆汁淤积型和混合型,不同的临床类型对应的临床治疗方案和预后亦不同。然而,本文对筛选队列中75例有病理分型的病例进行分析,结果发现,血清学R值分型与病理学实际损伤类型之间一致性检验Kappa值仅为0.044,远小于一致性检验限度0.2,说明R值分型与病理分型结果不一致,强烈提示血清学R值分型尚不能满足临床上对DILI靶细胞损伤类型的准确区分和诊断的需求。本文基于75例有病理分型的病例的血清代谢组学数据,以病理学分型为基准,建立了靶细胞损伤类型的代谢组学分类模型,模型的敏感度和特异度分别达到63.6%、73.6%、54.6%和98.4%、81.8%、72.0%;对比地,血清学R值分型其敏感度和特异度分别仅为45.4%、43.4%、36.4%和73.4%、50.0%、76.5%。外部验证中心的数据表明分类诊断模型比R值分型也具有很好的识别效果。上述结果提示,基于血清代谢组筛选建立的靶细胞损伤类型的分类模型具有较好的准确性,总体优于血清学R值分型方法,可望进一步研究并发展出新的低侵入性辅助诊断方法,在一定程度上用于替代或减少肝组织穿刺检查,具有较好的研究前景。4.与肝组织炎症或纤维化程度相关的代谢组学标志物筛查研究肝活检可为DILI临床诊断和评估提供重要信息,但存在禁忌症和依从性问题,寻找新的替代性的生物标志物具有重要意义。为此,本文基于有肝组织炎症和纤维化病理学检查的病例的血清代谢组学数据,分别筛查了可反映肝组织炎症程度以及可判断肝纤维化的两组生物标志物。结果表明,有41个血清标志物与肝组织炎症程度分级（G1～G4）高度相关,继而建立了肝组织损伤程度分级的代谢组学分类模型,该分类模型与病理检查结果存在一定的相关性（Kappa=0.321）。此外,有43个血清标志物与肝组织纤维化（S0～S4）高度相关,由这些代谢物建立的肝纤维化诊断模型与病理检查结果也存在较好的相关性（Kappa=0.741）,同时也可显著提高肝病APRI评分（aspartate aminotransferase-to-platelet ratio index,天门冬氨酸氨基转移酶/血小板比值指数）、FIB-4指数（fibrosis 4 score,4项因素的肝纤维化指数）诊断是否发生肝纤维化的效果（AUC=0.953、0.955）。在外部验证中心也观察到相似的结果。由此提示,基于血清代谢组筛查的生物标志物,可较好地监测和判断肝组织病理真实的损伤程度,进一步提示了其有望成为减少或替代肝穿的辅助诊断方法。5.基于血清代谢组的不同发病机制DILI的对比研究目前临床指南中通常将DILI的发病机制分为固有型、特异质型和间接型。上述分型主要是基于专家群体的经验性共识意见,尚缺少系统性的实验客观指标的表征和呈现。为此,本文从血清代谢组的层面,系统地对比考察了三种类型DILI间差异性的客观真实性。结果表明,固有型和特异质型DILI样本在无监督的PCA分析中,呈现出明显的差异,基本上区分为两群,提示这两种DILI类型至少在代谢组水平上是存在明显差异的。这一结果与近30年国际共识性意见对DILI分为固有型和特异质型两种不同发病机制的认识,是基本吻合的。本文的结果很好地支持了将固有型和特异质型DILI区分的主流观点。同时,我们将间接型DILI样本加入到PCA分析中,结果显示间接型DILI样本未呈现出一个独立的类群,而是与特异质型存在较多重叠（重叠样品的比例为45.4%）,提示2019年新提出的间接型DILI可能并不能作为一个独立存在的发病机制,至少与特异质型难以准确区分。新提出的间接型DILI还需要更多的临床和实验证据加以支持。此外,我们分别将中药何首乌DILI、补骨脂-淫羊藿DILI的样本纳入到PCA分析,尝试评估其肝损伤的可能类型,结果显示:所有的何首乌DILI样本均与已知的特异质型DILI样本位于同一类群,而与已知的直接型DILI样本呈现明显的分离效果,提示何首乌的肝损伤主要是特异质型而不是固有型,这一结果与课题组前期临床和实验研究结果以及与国内外各研究团队发表的文献中对何首乌肝损伤类型为特异质型的认识是一致的。据笔者初步检索,这是首次从代谢组的角度证实了何首乌DILI的发病机制为特异质型,这对正确认知何首乌肝损伤机理和开展科学防控提供了重要的参考依据。类似地,我们又将补骨脂-淫羊藿DILI样本纳入PCA分析,结果显示:75%的样本分布在已知的特异质型DILI类群,另外25%的样本分布在已知的直接型DILI类群,这提示补骨脂-淫羊藿DILI可能主要为特异质型损伤机制,但也不能排除固有型损伤机制。课题组前期实验研究以及其他研究团队文献报道表明,补骨脂中的部分成分是具有直接肝细胞毒性的,其损伤靶位在线粒体;而淫羊藿直接肝毒性弱,而表现为免疫应激介导的特异质肝损伤。本文的代谢组学评价结果与文献报道结果是基本一致和互为佐证的。通过以上DILI不同类型发病机制的分析,我们提出了针对性的风险防控建议:对于固有型/直接型肝毒性重点在于防“药”;对于特异质型和间接型肝毒性重点在于防“人”。6.DILI不同表型的生物标志物体现不同的生物学通路和潜在机制通过了解DILI不同分型的潜在机制,有助于临床诊断和药物的选择。为此,我们将上述筛查的DILI不同表型的生物标志物进行通路富集分析,结果表明,这些生物标志物体现了不同的生物学通路。这为揭示和阐释DILI分型的病理生理机制和病变进展过程提供了新的视角和研究基础。7.本研究存在局限性。纳入的样本只有筛选中心和外部验证中心两个医院的病例,还需要更多中心的、更大样本量的、前瞻性队列样本的验证。需要对重点通路和代谢物开展靶向代谢组学研究。对机制的分析主要是基于生物学通路富集分析和探讨,还有待分子生物学的验证性研究。综上所述,本研究基于筛选中心队列和外部中心队列,筛查和验证了与DILI分型和诊断相关的血清代谢组学生物标志物组合。这些生物标志物组合为DILI靶细胞损伤类型、损伤严重程度、肝组织炎症程度和肝纤维化以及慢性DILI肝硬化失代偿等提供了新的潜在评价指标和参考依据。基于整体代谢组的无监督多元统计学评价结果,系统和客观地呈现了DILI不同发病机制类型之间的差异性,为后续开展更多的DILI临床转化研究提供了独特的视角和参考依据。