食管癌是我国癌症的第四大死因,其死亡率高,预后差。目前食管癌治疗的基本方法是手术结合放化疗,但治疗效果仍然有限,食管癌患者的五年生存率仅为17%,低于我国肿瘤患者五年生存率的中位数。食管癌发生发展的机制尚不完全明确,因而必须深入了解食管癌发生发展机制,才能制定有效的治疗方案,进而降低食管癌的死亡率和发生率。食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是我国食管癌的主要类型,其发生发展过程与多个信号通路的异常激活有关。因此,筛选新的治疗靶点并制定有效的治疗方案是食管鳞癌临床亟待解决的问题之一。癌症基因谱研究发现食管鳞癌中存在79个促进ESCC发生发展的关键基因,这些基因涉及基因组稳定、细胞存活和细胞生存的12个信号转导通路,近期研究证实AKT、RAS等多个信号转导通路异常是促进食管鳞癌发生发展的因素之一,并参与ESCC的增殖、转移、分化等多个过程。因此,阐明食管鳞癌中的信号转导通路作用机制,筛选信号通路的关键靶点及其抑制剂,可以为阻断食管鳞癌发生发展制定有效的治疗方案,为提高ESCC患者生存率提供理论支持。T-LAK细胞来源的蛋白激酶(T-LAK cell-originated Protein kinase,简称TOPK),是一种新发现的丝-苏氨酸激酶,属于MAPKK分子家族,系统进化树显示它是MEK1/2和MKK7之间的分支,其参与多种生物学过程,如肿瘤的发生发展、细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡以及炎症等过程。TOPK的活化是有丝分裂早期的重要步骤,TOPK和cdk1/cyclin B1复合体结合,使胞质分裂蛋白1磷酸化,从而促使细胞分裂,从而加速细胞G2/M期进程促进细胞的增殖。TOPK激酶甚至可以和肿瘤抑制基因p53的DCD结构域相结合从而阻断p53的作用,促进细胞周期蛋白如p21的表达。近来研究还发现Cdk1激活调控的TOPK激酶活化后,可以瞬时调节在细胞分裂中的多种DNA连接蛋白,并且可以在几分钟内调控这些蛋白的前体。C2H2锌指蛋白就是这一大类保守蛋白,其包含有多个锌指结构域的保守区域,TOPK激酶是首个证实在有丝分裂中可以和这些保守区域结合进而调控整个转录因子的蛋白激酶。TOPK在白血病、淋巴瘤、乳腺癌、皮肤癌、宫颈癌、肺癌和结肠癌等多种恶性肿瘤中呈现高表达,并且和肿瘤预后密切相关。TOPK在这些不同的肿瘤中通过激活不同的信号通路参与肿瘤的发生发展和转移,甚至还参与了肿瘤耐药的形成,降低了肿瘤治疗的有效性。替普瑞酮和甲羟戊酸治疗抵抗的乳腺癌患者中,Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)诱导的TOPK蛋白表达增加对促进乳腺癌细胞增殖起到了重要作用。此外,报道TOPK激酶通过直接磷酸化c-Jun S73和S63促进肺癌细胞对EGFR抑制剂吉非替尼耐药性的产生。这些研究表明TOPK有可能成为肿瘤治疗的有效治疗靶点。然而,TOPK在食管鳞癌中的功能及其机制尚没有文献报道,因此,进一步研究TOPK在食管鳞癌中的功能及其机制可以为TOPK成为食管鳞癌的治疗靶点提供理论依据。本课题通过三个部分来研究TOPK在食管鳞癌中的功能及其机制,利用食管癌组织芯片检测TOPK在食管鳞癌中的表达水平,评价TOPK与食管鳞癌病理特征及患者预后的相关性;采用慢病毒载体、转染、筛选出TOPK低表达细胞系,和TOPK抑制剂HI-TOPK-032这2种方法评价TOPK下调对食管鳞癌细胞增殖的影响;进而通过激酶芯片技术探讨TOPK下调后引起的信号转导通路改变,将表面等离子共振技术(surface plasma resonance technology,SPR)和质谱(mass spectrometry,MS)联用筛选出TOPK激酶磷酸化的作用靶点Y盒子结合蛋白1(Y box protein1,YB1),MS筛选发现TOPK磷酸化YB1的位点Thr89和Ser209;以si RNA下调YB1的表达观察YB1在食管鳞癌细胞中的作用及其相关信号转导通路的改变;使用TOPK敲低稳定表达的食管鳞癌细胞系裸鼠移植瘤模型和构建的食管鳞癌患者来源的移植瘤(patient-derived xenograft,PDX)模型评价以TOPK为靶点在体内抑制食管鳞癌移植瘤生长的效果,为TOPK作为食管鳞癌患者靶向治疗的新靶标提供理论依据。第一部分TOPK在人食管鳞癌中的表达及其临床相关性评价方法:1以癌旁组织为对照,免疫组化方法检测组织芯片中100例食管鳞癌TOPK的表达。2统计分析TOPK与食管鳞癌患者临床病理特征(性别、年龄、分化和肿瘤浸润、淋巴结转移)的相关性,评价TOPK的表达与食管鳞癌患者预后的关系。结果:1与食管鳞癌癌旁组织相比,TOPK在食管鳞癌中高表达TOPK阳性表达主要于细胞浆和/或细胞核,呈不同强度棕黄色染色。根据score值不同分为低表达组(Score≤3)和高表达组(Score>3),100例病人中TOPK高表达66例,低表达34例,而癌旁正常组织中为阴性表达。2 TOPK的表达与食管鳞癌患者病理特征的相关性将TOPK的表达按照食管鳞癌临床资料(年龄,性别,分化,淋巴结转移和肿瘤浸润)进行统计学分析,结果显示,在无淋巴结转移食管鳞癌病人中TOPK低表达为21例,占43.48%,高表达为25例,占56.52%,在有淋巴结转移食管鳞癌病人中TOPK低表达13例,占25.93%,高表达41例,占74.07%,差异有统计学意义,X2=5.154,P=0.023。而TOPK的表达和食管鳞癌患者的年龄、性别、肿瘤的分化、肿瘤浸润程度没有相关性(P>0.05)。3 TOPK高表达预示食管鳞癌患者生存期短,预后差100例食管鳞癌患者中,TOPK高表达组患者为66例,存活期为19.82±2.03月;TOPK低表达组食管鳞癌患者为34例,生存期为49.75±5.89月,P<0.001。将食管鳞癌患者的生存期和TOPK的表达采用Kaplan-meier法进行存活相关性分析,经Log Rank统计检验,Cox多因素回归分析,结果发现TOPK的高表达与食管鳞癌患者生存期具有相关性(P<0.001)。第二部分下调TOPK抑制食管鳞癌细胞的增殖及其分子机制研究第一章下调TOPK对食管鳞癌细胞EC9706和TE13增殖的抑制作用方法:1 Western Blotting筛选食管鳞癌细胞系中TOPK表达情况。2慢病毒转染建立食管鳞癌细胞EC9706和TE13TOPK敲低稳定细胞系,Western Blotting评价转染效率。3 CCK8实验和软琼脂集落形成实验评价TOPK敲低后对食管鳞癌细胞系EC9706和TE13的增殖和克隆形成的抑制作用。4 CCK8实验和软琼脂集落形成实验评价TOPK抑制剂HI-TOPK-032对食管鳞癌细胞系EC9706和TE13的增殖和克隆形成的抑制作用。结果:1 TOPK在食管鳞癌细胞系中的表达和TOPK敲低稳定细胞系的建立TOPK在TE1、TE13、EC9706和EC1细胞系中呈高表达。通过慢病毒转染、筛选建立TOPK敲低稳定细胞系EC9706 sh TOPK#1和EC9706 sh TOPK#2,TE13sh TOPK#1和TE13 sh TOPK#2细胞系,其TOPK的表达相比对照组sh Mock明显下调。2敲低TOPK后抑制食管鳞癌细胞系EC9706和TE13的增殖和克隆形成CCK8实验结果发现与对照组相比,在EC9706和TE13细胞中敲低TOPK明显抑制细胞增殖;软琼脂集落形成实验结果发现与对照组相比,在EC9706和TE13细胞中敲低TOPK明显抑制克隆形成。3 TOPK抑制剂HI-TOPK-032抑制食管鳞癌细胞系EC9706和TE13的增殖和克隆形成CCK8实验和软琼脂集落形成实验发现与对照组相比,HI-TOPK-032明显抑制EC9706和TE13细胞的增殖和克隆形成。第二章下调TOPK抑制食管鳞癌细胞系中信号通路的激活方法:1利用蛋白激酶芯片检测TOPK敲低对EC9706细胞内信号转导通路的影响2 Western blotting方法验证TOPK敲低后EC9706和TE13的信号通路的改变3 Western blotting方法检测HI-TOPK-032作用24h后对EC9706和TE13的信号通路的改变结果:1蛋白激酶芯片检测TOPK敲低对信号转导通路的影响芯片结果显示:和对照sh Mock组相比,Akt1/2/3 S473在EC9706sh TOPK#1和EC9706sh TOPK#2分别下降至0.33和0.49倍;Akt1/2/3 T308分别下降至0.85和0.51倍;p70S6kinase T421/S424分别下降至0.57和0.23倍;ERK1/2 T202/Y204分别下降至0.81和0.79倍。2 Western blotting法验证蛋白激酶芯片结果EC9706和TE13中敲低TOPK或HI-TOPK-032作用均可抑制AKT/m TOR/p70S6K和ERK信号通路的激活,该结果和蛋白激酶芯片结果一致。第三章TOPK下游分子靶点的研究方法:1通过表面等离子共振技术筛选TOPK激酶在EC9706细胞中的作用靶点,结合质谱分析结果和验证,推测出Y盒子结合蛋白1(Y-box binding protein 1,YB1)是TOPK下游靶点之一。2免疫组化观察TOPK和YB1在食管鳞癌组织中的共定位,细胞免疫荧光方法观察TOPK和YB1在食管鳞癌细胞EC9706和TE13中的共定位。3免疫沉淀方法检测外源性和内源性TOPK和YB1的结合情况。4体外激酶检测TOPK激酶能否磷酸化YB1,质谱分析TOPK激酶磷酸化YB1的具体位点。结果:1 SPR和MS技术联用筛选在EC9706中与TOPK激酶结合的蛋白SPR获得的EC9706蛋白进行质谱分析,将GST-TOPK蛋白、TOPK激酶组和对照组进行比较,选取Score值大于25的蛋白。我们重点分析与TOPK激酶结合的32个蛋白,经过二级质谱确定,我们选定YB1作为下一步研究的对象,推测TOPK激酶激活YB1进而参与TOPK激酶下游信号转导通路的激活。2 TOPK与YB1在食管鳞癌组织和食管鳞癌细胞中共定位免疫组化结果显示YB1和TOPK在食管鳞癌组织中能够同时出现在细胞浆内,免疫荧光结果显示,食管鳞癌细胞系EC9706和TE13里,TOPK与YB1能够同时出现于细胞质中。说明TOPK与YB1在食管鳞癌细胞中能够共定位。3内外源性TOPK与YB1可以相互结合通过免疫共沉淀证实HEK293细胞里过表达的TOPK和过表达的YB1相互结合,证实HEK293细胞中外源性TOPK能与YB1结合;EC9706细胞中YB1能够被TOPK抗体特异性地下拉,证实EC9706细胞中内源性TOPK能与YB1结合。4 TOPK在体外磷酸化YB1蛋白的Thr89和Ser209体外激酶实验证实TOPK激酶能够在体外磷酸化YB1;扩大体外激酶样本量,通过质谱筛选到证实体外TOPK磷酸化YB1的两个磷酸化位点是Thr89和Ser209。第四章YB1在食管鳞癌细胞系EC9706和TE13细胞增殖中的作用方法:1采用Western Blotting方法检测多个食管鳞癌细胞系中YB1的表达。2通过si RNA干扰食管鳞癌细胞系EC9706和TE13细胞中YB1的表达,进一步以CCK8和软琼脂集落形成实验评价YB1下调对EC9706和TE13细胞增殖和克隆形成的影响。3 Western Blotting法检测通过si RNA干扰YB1下调后对TOPK,p-TOPK及AKT/m TOR/p70S6K和ERK信号通路的影响。1 YB1在食管鳞癌细胞系中的表达为了评价YB1在食管鳞癌中的表达,我们检测了多个食管鳞癌细胞系中YB1的表达,结果显示YB1在多个食管鳞癌细胞系中均呈现不同程度表达,提示YB1的高表达和食管鳞癌细胞的生物学特性相关。2下调YB1抑制食管鳞癌细胞系EC9706和TE13的生长和克隆形成si RNA结果显示YB1在食管鳞癌细胞系EC9706和TE13中的表达明显降低,CCK8实验和软琼脂集落形成实验结果显示下调YB1的表达可以抑制EC9706和TE13细胞的增殖和克隆形成。3下调YB1对食管鳞癌细胞系EC9706和TE13中p-TOPK和TOPK的表达无影响,而抑制AKT/m TOR/p70S6K信号转导通路的激活Western blotting结果证实,在EC9706和TE13细胞中,下调YB1对p-TOPK和TOPK的表达并无影响,却明显抑制AKT/m TOR/p70S6K信号通路的活化,对ERK通路影响较小。结果:第三部分下调TOPK对EC9706细胞移植瘤和人食管鳞癌组织来源的移植瘤生长的抑制作用第一章TOPK下调抑制食管鳞癌细胞生长方法:1构建EC9706sh Mock、EC9706 sh TOPK#1和EC9706sh TOPK#2细胞裸鼠移植瘤模型,通过测量肿瘤体积大小,小鼠体重、饮食饮水来评价TOPK敲低后在体内对食管鳞癌细胞增殖的影响。2通过免疫组化评价裸鼠移植瘤模型中增殖相关蛋白Ki67、TOPK和p-TOPK及TOPK下游信号通路的变化。结果:1裸鼠移植瘤生长期间移植瘤体积、小鼠体重、饮食和饮水的改变情况皮下注射细胞后第7d开始测量肿瘤体积,第13d即可观察到实验组与对照明显差异;生长期间实验组小鼠体重、饮食和饮水和对照组无差异。2实验结束时各组移植瘤体积、质量的情况第21d处死小鼠,测量各组移植瘤体积,并称量各组移植瘤质量,结果发现与对照组相比,EC9706sh TOPK#1和EC9706sh TOPK#2组瘤体积和质量均减少(P<0.001)。3免疫组化检测移植瘤中信号通路的激活情况免疫组化结果发现与对照组相比,移植瘤中EC9706sh TOPK#1和sh TOPK#2组中TOPK、p-TOPK、Ki67和AKT、m TOR和p70S6K磷酸化水平下降(P<0.05)。第二章构建人食管鳞癌组织来源的移植瘤模型方法:1通过收集人食管鳞癌患者手术标本26例,皮下移植入重度联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency,SCID)小鼠,生长,传代。2通过绘制移植瘤生长曲线、HE染色和CK5/6、p40、p60的免疫组化评价评价构建的PDX模型。结果:1食管鳞癌病人临床资料26个病例中,14例病人成功建立PDX模型,成功率为53.8%。26个病人中17个男性,9个女性,年龄范围为46-82岁,II期17人,III期3人,II-III期2人,I期3人,I-II期1人。2 ESCC PDX移植瘤的生长曲线、病理学评价及免疫组化分析从建立的14例ESCC PDX移植瘤模型中,选取EG2,EG3和EG5三例为代表,生长曲线结果显示第三代肿瘤生长时间较前两代缩短;HE病理和CK5/6、p40、p63免疫组化结果发现移植瘤组织病理类型和3个指标阳性表达与原代病人肿瘤组织一致。第三章HI-TOPK-032抑制人食管癌组织来源的移植瘤模型的生长方法:1用Western blotting方法从构建成的ESCC PDX模型中筛选出p-TOPK阳性(EG5)和阴性(EG2)表达的移植瘤模型为对象,用TOPK抑制剂HI-TOPK-032分别对EG5和EG2两例移植瘤进行治疗,通过测量两例移植瘤体积大小,小鼠体重、饮食饮水来评价TOPK抑制剂HI-TOPK-032对人食管鳞癌组织生长的影响。2通过免疫组化评价HI-TOPK-032治疗的两组ESCC PDX模型移植瘤中p-TOPK、p-AKT473、p-m TOR,p-p70S6K等信号转导通路蛋白及细胞增殖指标Ki67的变化。结果:1病人的临床资料p-TOPK阳性病例EG5和p-TOPK阴性病例EG2均来自郑州大学第一附属医院,食管鳞癌手术前均没有进行放化疗。EG2和EG5的病人均为食管鳞癌,男性,年龄分别为64岁和61岁,分化类型分别为中高分化和中分化,二者分期均为IIa(T2N0M0)期,均无远处淋巴结转移。2 HI-TOPK-032治疗期间的小鼠移植瘤的体积、体重、饮食和饮水的改变情况EG5移植瘤从给药第12天起,给药组比对照组移植瘤体积减少,P=0.002。而EG2移植瘤给药过程中给药组比对照组移植瘤体积未见到明显差异。每周两次称量EG5和EG2组小鼠体重、饮食、饮水发现给药组和溶剂对照组的没有差异,P>0.05。3实验结束时各组小鼠移植瘤体积、质量的情况实验在第29天终止,EG5治疗组瘤体积与对照组相比明显减小(P=0.001)。而EG2移植瘤体积对照组和治疗组差异不明显,P>0.05。EG5治疗组瘤质量与对照组明显减少,P=0.004;而EG2移植瘤质量治疗组和对照组差异不明显,差异没有统计学意义,P>0.05。4免疫组化检测PDX模型中信号通路蛋白磷酸化的改变情况经HI-TOPK-032治疗的TOPK阳性EG5组移植瘤组织EG5中p-TOPK、p-AKT473、p-m TOR,p-p70S6K等信号转导通路蛋白及细胞增殖指标Ki67明显降低,差异具有统计学意义,P<0.05。而在TOPK阴性的EG2组人食管鳞癌移植瘤组织中各指标改变不明显,差异没有统计学意义,P>0.05。全文结论1 TOPK在食管鳞癌中的表达比癌旁正常组织增高,和食管鳞癌患者淋巴结转移密切相关,和食管鳞癌病人预后呈相关,而与食管鳞癌病人的其他临床特征(性别、年龄、分化和肿瘤浸润)无关。2降低TOPK的表达可以抑制食管鳞癌细胞的增殖和食管鳞癌移植瘤的生长,提示TOPK在食管鳞癌增殖中发挥重要作用,TOPK有望成为食管鳞癌预防和治疗的重要分子靶标。3降低TOPK的表达可以抑制AKT/m TOR/p70S6K和ERK信号通路的激活,TOPK激酶在Thr89和Ser209位点磷酸化YB1,下调YB1可以抑制食管鳞癌细胞的增殖和AKT/m TOR/p70S6K信号通路的激活,提示TOPK磷酸化YB1进而激活AKT/m TOR/p70S6K信号通路是TOPK促进食管鳞癌细胞增殖的机制之一。4成功构建人食管鳞癌组织来源的移植瘤模型,为进一步研究食管鳞癌发生发展机制,筛选有效分子靶点和评价食管鳞癌个体化治疗方案提供临床前平台。