神经干细胞(Neural Stem Cells，NSCs)是一类具有自我更新能力并能向神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞分化的神经前体细胞。已有研究表明，在体移植的NSCs能特异性地迁移至脑部损伤区域，缓解神经退行性疾病的症状，从而为治疗各种神经退行性疾病提供可能。但是这类细胞移植疗法临床上仍难以实现应用，例如细胞来源，移植剂量和移植时间及副作用等都是有待明确的问题，所以发现能够调控内源性的NSCs的分化的外源性的小分子对神经退行性疾病的治疗具有重大意义。　　通过本实验室已经建立的，基于中枢神经系统中特异表达Nestin启动子的骨髓间充质干细胞双荧光报告平台，我们筛选到了一个能够显著影响干细胞标志物Nestin表达的小分子化合物Yhhu4952。为了明确该化合物的具体作用，我们利用海马NSCs培养体系考察了其对神经元，星状胶质细胞和少突胶质细胞三个方向分化的影响，实验结果表明，该化合物能够剂量依赖性地促进神经元标志性蛋白Tuj-1的表达，说明Yhhu4952化合物能够促进NSCs向神经元方向的分化。该化合物还能减少星状胶质细胞标志性蛋白GFAP的表达，抑制NSCs向星状胶质细胞方向的分化。Yhhu4952在0.3μM作用浓度时显著增加了未成熟少突胶质细胞标志物O4和O1阳性细胞所占的百分比，形态学上表现出细胞突起增长，分支增多的形态，说明能够促少突前体细胞分化。但随着作用浓度的增加，O4和O1阳性细胞所占的百分比又显著减少，形态上对少突前体细胞分化也表现出了抑制作用。　　利用Western blot和NSCs培养体系研究Yhhu4952化合物的作用机制表明:该化合物能够促进Wnt辅助受体LRP6和正调控因子Dvl2蛋白的表达，并剂量依赖性地降低负调控因子Naked2的表达，说明化合物能够激活Wnt信号通路。我们还发现该化合物能够剂量依赖性地抑制Notch1的蛋白表达，说明Yhhu4952还具有抑制Notch1信号通路的作用。继而我们还对少突胶质细胞谱系发育密切相关的两个转录因子Olig1和Olig2的转录水平进行了检测，结果表明该化合物不显著影响Olig2的转录水平但是能够剂量依赖性地促进Olig1转录因子的表达。以上多种信号共同参与了Yhhu4952对NSCs的分化的调控。　　由于少突前体细胞(OPCs)在如多发性硬化症(MS)的脱髓鞘疾病的病灶区分布广泛并且能够为髓鞘再生提供细胞来源，所以如何调动OPCs进行髓鞘再生修复是近年来MS药物研发的一个重要方向，但是目前具有这方面功能的化合物极为稀缺。由于Yhhu4952具有调控OPCs的分化的作用，所以我们进一步在体外OPCs和整体动物水平考察该化合物对少突胶质细胞的具体作用。　　在成功建立了OPCs培养体系后，我们考察了Yhhu4952化合物对少突胶质细胞各发育时期的标志物的表达，实验结果表明:Yhhu4952化合物能够显著减少PDGFRα的比例同时增加O4、O1和成熟少突胶质细胞标志物MBP的百分比，说明该化合物在体外能够剂量依赖的促进OPCs的成熟分化。为明确该化合物是否能进入中枢神经系统发挥作用，我们首先检测了Yhhu4952在脑实质和血浆中的时间-浓度分布，结果表明Yhhu4952腹腔给药15min后即能够迅速入血并通过血脑屏障，在脑实质的最大浓度为血浆中浓度的2.53倍，说明该化合物能够迅速进入脑发挥作用。　　为明确Yhhu4952在髓鞘发育过程中的作用，对新生第2天的大鼠每日给予Yhhu4952化合物至第10天，并利用免疫荧光染色和Western blot手段考察大鼠胼胝体区髓鞘的发育情况，结果表明该化合物能够显著增加胼胝体区MBP的蛋白的表达并增加单位面积CC1标记的成熟少突胶质细胞的数量，说明Yhhu4952化合物能够显著促进髓鞘的发育过程。　　为了明确Yhhu4952化合物在脱髓鞘病理模型中的作用，我们首先采用了铜腙模型评价了Yhhu4952化合物的作用。小鼠经铜腙造模6周后，每日连续给予4周Yhhu4952化合物，利用快蓝和MBP免疫荧光染色评价了化合物对髓鞘再生过程的作用。结果表明:Yhhu4952化合物组在给药第3周和第4周能够显著增加MBP蛋白的表达和髓鞘再生的区域面积百分比，说明化合物能够促进铜腙小鼠的髓鞘再生过程。　　实验性变态反应性脑脊髓炎动物(EAE)模型也是诱发动物脱髓鞘的一种病理模型，其致病机理与人类的多发性硬化症(MS)最为相似。为了探究该化合物是否对EAE模型小鼠的病情有改善作用，我们在EAE模型构建完成后，每日按照经典的“5分制”进行临床评分，发现该化合物组在EAE发病早期（第22-23天）能够显著改善EAE的发病症状，但是并不足以应对持续的免疫攻击，从第24天起可观察到明显的复发。为了明确这种运动的改善作用是否与髓鞘再生有关，我们取发病第22天的小鼠脊髓切片进行了MBP和PDGFRα免疫荧光染色，并统计了脊髓白质区的MBP相对荧光强度和每个视野PDGFRα的个数，结果发现Yhhu4952组小鼠能够部分恢复MBP蛋白的表达，PDGFRα阳性细胞个数与模型组小鼠相比显著减少，与Yhhu4952在体外OPCs的研究结果一致，即Yhhu4952化合物能够促进病灶区OPCs的分化为成熟的少突胶质细胞，从而加速髓鞘再生过程。为了更加直观的观察EAE小鼠髓鞘损伤和在修复的过程，还对造模第22天的EAE小鼠脊髓白质区进行了电镜观察，镜下髓鞘的形态表明:Yhhu4952处理组的小鼠损伤情况显著优于模型组，髓鞘厚度以及包裹的轴突数量明显多于模型组小鼠，髓鞘厚度比G-ratio值显著低于模型组，说明给予Yhhu4952后能够促进髓鞘再生的过程，改善小鼠髓鞘损伤程度。　　我们利用Western blot和Real-time PCR手段在体外对Yhhu4952的机制进行了初步研究。实验结果表明化合物能够剂量依赖性地降低Notch1蛋白表达及其下游效应因子Hes5的转录，说明该化合物能够抑制Notch1介导的信号通路。我们还建立了少突胶质细胞-星状胶质细胞共培养体系激活Jagged1-Notch1信号通路模拟MS的病理微环境，在证明了Jagged1-Notch1信号通路的激活后，MBP数目显著减少，而Yhhu4952化合物能够显著逆转这种分化抑制，MBP标记的成熟少突胶质细胞的数量显著增加。以上结果共同表明Yhhu4952能够通过抑制Notch1信号通路实现促OPCs分化的作用。　　综上所述，Yhhu4952作为一个新型小分子化合物，首次被被证明能够促进OPCs分化成熟和髓鞘再生过程，该化合物也许能够为促髓鞘再生方向的药物研发提供新思路。