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法夫酵母是最具潜力实现天然虾青素产业化的微生物资源,但虾青素产量低是限制其大规模发酵生产的核心因素。本研究针对这一问题,首先建立了法夫酵母清液回流发酵工艺和乙醇补料工艺。其次,采用代谢通量分析探究乙醇促进虾青素合成的代谢机理。最后,对法夫酵母生物合成虾青素的代谢控途径进行了细致的分析和调控。主要结论如下:(1)发酵上清液作为发酵工业的废弃物,用来培养法夫酵母JMU-VDL668,50%添加量时虾青素产量提高28%,补全培养基成分后,虾青素产量提高了35%;而培养JMU-MVP14时,100%添加量时虾青素产量达到57.98 mg/L,补全培养基成分后,虾青素产量达到61.51 mg/L。摇瓶反复分批发酵5批次,基本上保证了两株菌虾青素的产量。罐上反复分批补料2批次,JMU-VDL668的虾青素产量提高了38%;JUM-MVP14的虾青素产量提高了63%,最终收获153.88 mg/L的虾青素。(2)低浓度的乙醇可提高两株菌发酵虾青素的能力,较高浓度的乙醇则会抑制细胞的生长。培养法夫酵母JMU-VDL668时添加5 g/L乙醇,虾青素产量是对照组的2.4倍。控制JMU-MVP14发酵过程中乙醇添加浓度维持在2 g/L,并每24 h补加葡萄糖,最终虾青素的浓度达到55.32 mg/L,与对照相比提高了38.4%。对比罐上乙醇补料工艺得知,低糖浓度下补加乙醇更有利于细胞生长和虾青素积累,其中JMU-VDL668的虾青素产量提高了2.7倍。(3)通过代谢通量分析发现乙醇促进了法夫酵母细胞代谢中丙酮酸、乙酰辅酶A代谢节点处的通量,进而促进了虾青素的合成。JMU-VDL668自身合成的乙醇被消耗后,乙酰辅酶A、α-酮戊二酸、5-磷酸核酮糖代谢节点处通量增大。对α-酮戊二酸和5-磷酸核酮糖代谢节点进行调控发现,适宜浓度α-酮戊二酸均能促进两株菌合成虾青素。添加3 g/L的谷氨酸时,JMU-VDL668的生物量可达8.2 g/L,JMU-MVP14的虾青素产量高达67.88mg/L,是对照组的1.7倍。(4)选择了5种虾青素合成途径中关键酶的特异性抑制剂,用来调控法夫酵母的发酵过程。研究发现,烟碱、异烟肼均能提升法夫酵母胞内β-隐黄质的含量;辛伐他汀添加后JMU-MVP14虾青素合成途径中的中间类胡萝卜素基本上都转化为了虾青素,虾青素的比例从82.37%提升至98.64%。将抑制剂与乙醇组合添加至培养基中发现:乙醇对辛伐他汀、N-甲基吗啉引起的代谢抑制有补救作用,而与烟碱、β-紫罗兰酮组合时则有叠加的抑制效应。