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胃癌是常见的恶性肿瘤之一,在消化道恶性肿瘤中其发病率和死亡率居首位。外科手术是治疗胃癌的主要手段,但5年存活率很低。化疗和放疗在杀死癌细胞的同时也会损伤正常组织的细胞,且患者有严重的不良反应。因此,寻找更多基因治疗的靶点对提高胃癌的治疗水平及患者的生存率成为临床研究的热点。 调控细胞周期阻滞和细胞凋亡的锌指蛋白(zinc finger protein which regulatesapoptosis and cell cycle arrest,ZAC)为一种转录因子,具有转录活化活性和DNA结合功能,可诱导细胞凋亡和细胞G1期阻滞,从而抑制肿瘤细胞生长。前期的研究表明胃癌组织ZAC基因及生长抑素(somatostatin,SST)表达均下调,且二者呈明显正相关,参与胃癌的发生。为观察SST是否可诱导胃癌细胞ZAC基因的表达,本研究观察了SST类似物奥曲肽(octreotide,OCT)对胃癌细胞系BGC823和SGC7901 ZAC基因表达的效应;为评定ZAC基因在SST抑制胃癌细胞生长通路的作用,本实验应用RNA干扰技术建立了ZAC基因敲低(knock-down)胃癌细胞系(ZAC-KD),观察ZAC基因沉默后OCT孵育对胃癌细胞的生长抑制作用及细胞凋亡的作用。 方法: 1.MTT法筛选OCT作用的最佳条件用1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L和1000nmol/L的OCT孵育胃癌细胞系BGC823及SGC7901,分别于12h、24h和48h后,应用MTT技术检测生长抑素对胃癌细胞增殖效应,筛选OCT抑制胃癌细胞增殖最佳作用浓度和作用时间。 2.OCT对胃癌细胞ZAC基因的效应以最佳浓度和时间OCT孵育胃癌细胞系BGC823和SGC7901,应用Western blot检测OCT对胃癌细胞ZAC基因表达的效应。 3.构建ZAC-shRNA表达载体根据ZAC基因在GenBank中所查到的mRNA序列,通过在线设计和同源性比较确定3条靶向ZAC基因的siRNA序列,交由生物公司合成互补性发卡样寡核苷酸。退火形成双链后,插入pSUPER-EGFP-I质粒中,构建3个ZAC-shRNA表达载体:pSUPER-EGFP-Z1、pSUPER-EGFP-Z2和pSUPER-EGFP-Z3。HindⅢ/EcoRⅠ双酶切及序列分析鉴定。 4.建立ZAC-KD胃癌细胞系转染前胃癌细胞系BGC823和SGC7901的培养体系采用无抗生素培养基。各质粒提取均采用无内毒素质粒提取试剂盒。分实验组(分别转染质粒pSUPER-EGFP-Z1、pSUPER-EGFP-Z2和pSUPER-EGFP-Z3)、实验对照组质粒(转染质粒pSUPER-EGFP-I)和对照组(无质粒转染)。应用脂质体LipofectamineTM2000转染,G418选择性筛选近3周。RT-PCR技术检测ZAC mRNA水平,建立ZAC基因敲低的BGC823细胞系和SGC7901细胞系,分别命名为ZAC-KD/BGC823和ZAC-KD/SGC7901。 5.OCT孵育对ZAC-KD胃癌细胞系细胞增殖及细胞凋亡的效应以最佳浓度和时间OCT孵育胃癌细胞系BGC823、ZAC-KD/BGC823、SGC7901和ZAC-KD/SGC7901,应用MTT法和流式细胞技术观察OCT对胃癌细胞增殖和细胞凋亡的效应。 6.统计学处理所有数据以均数±标准差((x)±s)表示,应用SPSS11.5统计软件处理数据, P<0.05为差异有显著性。 结果 1.OCT作用最佳条件MTT结果显示,OCT对胃癌细胞的增殖抑制效应具有浓度和时间依赖性;10nmol/L,作用24h,OCT对胃癌细胞系BGC823和SGC7901的增殖抑制效应最佳。 2.OCT对胃癌细胞ZAC基因的效应1nmol/L~1000 nmol/L的浓度范围内,OCT以浓度依赖的方式诱导胃癌细胞BGC823和SGC7901ZAC基因的表达;12h~48h范围内,10nmol/L OCT以时间依赖的方式诱导胃癌细胞BGC823和SGC7901 ZAC基因的表达。 3.ZAC-shRN表达载体构建酶切及测序鉴定,插入片段正确,3个shRNA表达载体,pSUPER-EGFP-Z1、pSUPER-EGFP-Z2和pSUPER-EGFP-Z3构建成功。 4.建立ZAC-KD胃癌细胞系ZAC和β-actin扩增的片段分别为428 bp和250bp。BGC823细胞转染pSUPER-EGFP-Z1、pSUPER-EGFP-Z2、pSUPER- EGFP-Z3、pSUPER-EGFP-I和对照组的ZAC/β-actin灰度比值的均值分别为0.982±0.017、0.463±0.051、0.935±0.026、1.135±0.055和1.233±0.050; SGC7901细胞转染pSUPER-EGFP-Z1、pSUPER-EGFP-Z2、pSUPER-EGFP-Z3、pSUPER-EGFP-I和对照组的ZAC/β-actin灰度比值的均值分别为0.956±0.047、0.527±0.010、0.966±0.014、1.107±0.003和1.156±0.007。转染pSUPER-EGFP-Z2的BGC823和SGC7901细胞ZAC mRNA水平均均明显降低(P<0.05)。结果表明,转染pSUPER-EGFP-Z2的胃癌细胞系为ZAC-KD胃癌细胞系。 5.OCT孵育对ZAC-KD胃癌细胞系细胞增殖及细胞凋亡的效应MTT结果显示,BGC823、ZAC-KD/BGC823、SGC7901和ZAC-KD/SGC7901细胞增殖率分别为0.383±0.014、0.469±0.012、0.368±0.016和0.434±0.012; OCT孵育后,细胞增殖率分别为0.306±0.006、0.450±0.011、0.274±0.013和0.415±0.007。ZAC-KD/BGC823和ZAC-KD/SGC7901细胞增殖率均明显增高(P<0.05)。OCT孵育后,胃癌细胞系BGC823和SGC7901细胞增殖率均明显下降(P<0.05);而ZAC-KD/BGC823和ZAC-KD/SGC7901细胞增殖率无明显改变(P>0.05)。流式细胞结果显示,OCT孵育后,ZAC-KD/BGC823和ZAC-KD/SGC7901细胞凋亡率(7.29%和7.19%)均低于其相应的胃癌细胞系BGC823和SGC7901(26.72%和28.21%)。 结论 1.OCT以浓度和时间依赖的方式诱导胃癌细胞系BGC823和SGC7901 ZAC基因表达。 2.ZAC基因在SST抑制胃癌细胞生长通路中具有重要作用。