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脊椎动物的附肢(limb)是一个具有多种不对称结构的复杂器官。不同的物种,附肢发育的最后形态差异很大,但是附肢的发育机制却十分类似。脊椎动物附肢都是由体壁中胚层和外胚层共同发育而来,发育过程中同时受到前-后轴、背-腹轴和近-远轴三个方向轴的调控。 一直以来,人们认为附肢前-后轴的形成是Sonic Hedgehog(Shh)信号和下游Gli3转录因子相互拮抗的结果。当缺乏Shh信号时,Gli3将被剪切为转录抑制因子Gli3R,因此推断Shh基因突变的小鼠应该与仅产生转录抑制因子Gli3R的小鼠具有相似的表型。但是事实并非如此,人们为了模拟Palliser-Hall综合症培育出的转基因小鼠Gli3Δ699,该小鼠Gli3基因的C端转录提前终止,产生模拟Gli3R活性的蛋白。然而Gli3Δ699小鼠的前肢可以成4-6个指,与Shh基因突变小鼠产生短小的几乎没有指的附肢现象完全不同。Shh信号仅通过抑制Gli3R的活性构建附肢前-后轴的理论受到质疑。 在本文中,我们利用Cre重组酶的条件性打靶技术重新培育了仅在附肢表达Gli3R的小鼠Gli3Δ701。Gli3Δ701小鼠具有与Shh基因突变小鼠类似的短小几乎无指的前肢。我们通过实验发现通常依赖于Shh信号参与附肢发育的相关基因在Gli3Δ701小鼠和Shh基因突变小鼠中均不能表达。同时我们证实了在附肢发育中,对这部分基因的抑制作用是独立于Shh信号之外的,即仅通过Gli3R就可以抑制这部分基因的表达。因此我们的研究为一直具有争议的Shh信号仅通过Gli3R构建附肢前后轴的假说提供了重要的证据。 近来的研究显示脊椎动物Shh信号的传导是在初级纤毛结构中完成的,Shh信号参与调控初级纤毛发生的生物机制仍不清楚。最早在鸡中发现的Talpid3蛋白能够参与纤毛间蛋白的运输,纤毛生成以及Shh信号的传导。为此我们培育了Talpid3-/-的小鼠,发现在Talpid3-/-的小鼠中,细胞的初级纤毛结构缺失,细胞存在多个中心体的现象,并且中心体蛋白Cep120(centrosomal protein120)的结合位点发生了变化。通过免疫共沉淀实验我们证实了Cep120与Talpid3蛋白之间的相互作用。同时我们通过构建能够稳定表达Talpid3以及Flag和 HA标签的融合蛋白细胞株,证明了Talpid3保守的coiled-coil结构域能够参与招募与PKA。在初级纤毛结构中,我们认为Talpid3的具有锚定蛋白的功能。一方面Talpid3参与锚定Cep120蛋白,帮助构建基粒(basal body)和子代中心粒(daughter centriole),从而确定了初级纤毛的生长位置;另一方面,Talpid3通过结合PKA,调节PKA催化蛋白质磷酸化的活性,实现对Shh通路下游信号的调控。