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NKX2.5位于人类染色体5q34,包含2个外显子,编码324个氨基酸,蛋白大小为35 kDa。NKX2.5蛋白具有3类保守的结构域：TN结构域、Homeodomain (HD)结构域和NK2-SD (NK2 specific)结构域。NKX2.5是心脏发育中重要的转录因子,在心脏的早期发育以及在成熟心脏的功能维护中起重要的作用。在小鼠模型中,E7.5时期NKX2.5在心肌发生板的内胚层和中胚层细胞核中就开始强烈表达。NKX2.5-/-的小鼠心脏环化受阻,约在E10.5时期胚胎致死。人类NKX2.5突变引起先天性心脏病(Congenital heart disease, CHD),产生房间隔缺损(Aterial septal defect, ASD)、传导系统异常以及形成心脏畸形等。已经报道的NKX2.5突变有错义突变、无义突变、插入突变和缺失突变。目前,NKX2.5基因型和先天性心脏病表型的关系仍不够确定,NKX2.5蛋白在心脏发育中的具体分子机制还不清楚,寻找新的NKX2.5突变,研究其基因型和表型的关系以及NKX2.5突变的功能,有利于更加了解NKX2.5在心脏发育中的作用,并为寻找治疗基因缺陷的方法提供可能。在第1部分的研究中,我们收集到一个先天性心脏病家系,疾病表型为房间隔缺损、房室传导阻滞(Atrioventricular block, AVB)、心室致密化不全(Noncompaction)、晕厥(Syncope)和猝死(Sudden death)。我们对家系样本进行NKX2.5直接测序分析。我们发现了一个与疾病共分离的、全新的NKX2.5杂合2 bp插入突变,位于第2号外显子,命名为L171RfsX5,该突变导致第171位氨基酸移码,并在第175位氨基酸后终止。通过Swiss Model Service服务器预测,突变L171RfsX5所编码的截短蛋白导致NKX2.5的保守HD的结构改变,缺失了HD的第二个螺旋的C端和第三个螺旋。对该突变构建真核表达质粒,转染HeLa细胞,功能研究发现野生型NKX2.5蛋白定位于细胞核而突变编码的蛋白分布于细胞核和细胞质；野生型蛋白能使ANFp-Luc的转录活性增强约5倍,而突变蛋白完全丢失转录活性。这些结果表明了L171RfsX5是一个功能性突变,这是第一次在人类NKX2.5突变中发现心室致密化不全表型,扩展了NKX2.5突变的表型谱。在第2部分的研究中,我们对125例汉族散发先天性心脏病患者进行NKX2.5突变扫描分析,目的在于寻找汉族散发先天性心脏病样本中NKX2.5的突变情况。我们发现单核苷酸多态rs2277923 (Single nucleotide polymorphism, SNP)在病人中具有较高的频率,与105例对照样本相比,小等位基因A的频率显著(P=0.04),显示NKX2.5 SNPrs2277923可能与汉族先天性心脏病的发生相关,还需要加大样本分析。功能研究表明SNP rs2277923 (63a>g)编码的蛋白定位于细胞核,和野生型相比约降低20%的转录活性。在第3部分的研究中,我们对8个已经报道的NKX2.5无义突变进行结构和功能分析和氨基糖苷类抗生素诱导无义突变的通读实验。首先构建NKX2.5无义突变在pcDNA3.1载体上的表达质粒(pE109X, pQ149X, pQ170X, pQ187X, pQ198X, pY256X,pY259X和pC264X)和3个突变(E109X, Q149X和C264X)在pEGFP-N1上的融合蛋白表达质粒NKX2.5mut-EGFP。在HeLa细胞中对KX2.5的8个突变进行免疫荧光定位分析和双报告荧光素酶系统的转录活性检测。结果表明pQ198X, pY256X, pY259X能使ANFp-Luc的转录活性增加约2倍,pC264X和pWT-NKX2.5能使ANFp-Luc的转录活性增加4-5倍,而pE109X, pQ149X, pQ170X, pQ187X完全没有转录活性。pWT-NKX2.5, pQ198X, pY256X, pY259X和pC264X定位于细胞核,而pE109X,pQ149X, pQ170X, pQ187X的定位发生改变。接下来进行通读的定性试验,在HeLa细胞中转染突变的NKX2.5-EGFP分别加入氨基糖苷类抗生素庆大霉素(gentamicin)和G418,孵育48-72 h,荧光显微镜下观察EGFP的强度,判断无义突变是否有通读以及药物的工作浓度。然后,选择合适的药物浓度对8个无义突变质粒诱导通读,并通过检测诱导后转录活性的变化来估算通读效率。结构-功能的结果表明NKX2.5蛋白的C端对于其转录活性很重要；HD区域内的一段R/K富集的序列(Q187NRRYKCKRQR197)对于NKX2.5蛋白的正确定位是必须的。通读实验结果表明gentamicin和G418均能诱导8个NKX2.5无义突变通读,并且通读效率最高可达到13.8%和32.2%。该结果为携带NKX2.5无义突变的先天性心脏病病人的基因治疗提供了潜在的可能性。