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黄萎病(Verticillium wilt)是影响世界棉花生产的主要病害之一。育种实践证明,培育抗病品种是控制棉花黄萎病的经济有效途径。研究证明海岛棉Pima90-53对黄萎病具有高度抗性;对其抗黄萎病相关基因进行克隆研究不仅有利于阐明品种抗病机制,而且对棉花抗黄萎病的分子育种具有重要价值。本研究以海岛棉Pima90-53为材料,构建其在黄萎病菌诱导下的根系cDNA文库,并依据文库克隆棉花抗黄萎病相关基因。主要结果如下:1.构建了黄萎病菌诱导下的海岛棉Pima90-53根系的全长cDNA文库采用SMART技术成功构建了黄萎病菌诱导下的Pima90-53根系全长cDNA文库,该文库基础库容量为1.28×106PFU,重组率94%,扩增后文库滴度大于1010PFU·mL-1,插入片段平均长度1.1kb。经随机测序共获得45条cDNA序列,利用Blastx程序进行同源分析,4个contigs与假定抗病相关基因同源性较高;3个contigs没有注释,可能为新基因。2.利用文库筛选和RACE技术相结合,克隆了一个新的GbWRKY1基因利用构建的cDNA文库,结合RACE技术,获得了一个新WRKY基因(GbWRKY1)(GenBank No. JF831361)。GbWRKY1基因cDNA全长1971bp,包括5′端非编码区271bp,3′端非编码区230bp,含有1个可能的polyA加尾信号:AATAAT;基因开放阅读框为1470bp,编码一个由489个氨基酸构成的多肽。生物信息学分析发现GbWRKY1包括2高度保守的WRKY基本结构域和锌指结构,属于WRKY家族第Ⅰ类,与VvWRKY2、 AtWRKY4和AtWRKY3蛋白的同源性分别为62%、61%和59%;GbWRKY1属可溶性蛋白,无信号肽和跨膜结构域,包含N-糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、N端肉豆蔻酰化位点、酪蛋白激酶II磷酸化位点、依赖cAMP和cGMP蛋白激酶磷酸化位点等。GbWRKY1基因含有3个内含子,具有有保守的GT-AG剪切位点,分别为599bp、81bp、325bp。克隆得到GbWRKY1的1762bp启动子,包含植物病原诱导性启动子调控元件(RAV1AAT、Box-W1、ARE、W-box、CGTCA-motif、ERE、 TGACG-motif)与非生物胁迫应答元件(HSE、 TC-rich repeats、WRKY71OS、WBOXNTERF3、MYCATERD1)。构建了基因融合表达载体pCamE-GbWRKY1-GFP,基因枪转化洋葱内表皮细胞,结果显示转化pCamE-GbWRKY1-GFP表皮细胞的细胞核出现绿色荧光,GbWRKY1蛋白定位于细胞核。3. Northern杂交分析了GbWRKY1在黄萎病菌接种后的表达模式,揭示了基因与棉花抗黄萎病的联系;实时定量PCR分析了GbWRKY1在不同激素处理下的表达模式,为解析基因作用机制提供了依据;构建了GbWRKY1超表达与RNAi载体,获得了转基因T3拟南芥Northern杂交分析GbWRKY1表达模式发现,基因在Pima90-53的根、茎和叶组织均有表达;在受黄萎病菌、SA、MeJA和ACC的诱导后呈现不同的表达模式。在黄萎病菌诱导后,GbWRKY1基因在接种后出现持续高表达,在8h出现表达高峰,并持续高表达至接菌后12h。SA诱导后,其表达量在12h降到最低,24h基本恢复正常水平;MeJA诱导后,GbWRKY1表达量上升,在12h达到高峰,24h出现下降;ACC诱导12h,GbWRKY1表达呈现明显上升,并持续到24h。构建了GbWRKY1基因超表达和反义载体pCamE-GbWRKY1、pCamE-iGbWRKY1,通过农杆菌介导法转化拟南芥,经潮霉素筛选和PCR检测,获得了GbWRKY1过表达转基因T3拟南芥。