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目的:本研究应用体外细胞培养方法,采用多种检测手段,观察苦参碱对乳腺癌MCF-7细胞的抑制作用和诱导细胞凋亡作用,并对其作用机制进行了初步探讨,为苦参碱应用于乳腺癌的临床辅助治疗提供理论依据。
方法:乳腺癌MCF-7细胞在RPMI-1640培养液中进行培养和传代,设立对照组和多种药物浓度实验组。实验组细胞加入不同浓度的苦参碱,对照组细胞加等量培养液进行如下实验。实验数据采用SPSS11.0统计软件进行统计分析。(1)用MTT法检测MCF-7细胞生长抑制率;(2)在倒置显微镜、正置光学显微镜、荧光显微镜下观察MCF-7细胞形态学变化;(3)应用流式细胞术(Flow cytometry,FCM)分别检测MCF-7细胞凋亡情况、MCF-7细胞线粒体跨膜电位及MCF-7细胞Bax、Bcl-2蛋白表达情况。
结果:
1.苦参碱对MCF-7细胞的生长抑制率测定
苦参碱作用于乳腺癌MCF-7细胞24h、48h和72h的生长抑制率分别介于6.01％～35.58％,7.97％～51.56％和11.98％～68.31％不同浓度的苦参碱对MCF-7细胞的生长抑制率与对照组相比存在显著差异(P＜0.05),且呈剂量一效应正相关及时间一效应正相关。
2.MCF-7细胞形态学改变
对照组MCF-7细胞生长良好,紧密排列,呈梭形或多突起形态,突起较长,细胞浆和细胞核均嗜碱性,可见较多的病理性核分裂象。没有发现凋亡细胞。实验组细胞突起短缩、胞浆减少,逐渐变圆,胞浆内可见大小不等的空泡,细胞浆嗜酸性随苦参碱浓度增高而逐渐增强。染色质凝集呈团块状,出现不同程度的核固缩、碎裂、核分裂相减少及核偏位,呈新月形,形似“印戒细胞”。少数细胞可见细胞膜向外膨出的“出芽”现象,个别细胞外形似玫瑰花环状。荧光显微镜下可见凋亡及坏死细胞,且随浓度的增高凋亡和坏死细胞也逐渐增多。这些形态学改变是细胞凋亡过程中不同阶段的形态特点。
3.流式细胞仪检测MCF-7细胞凋亡
苦参碱对MCF-7细胞有明显的诱导凋亡作用。药物作用24h细胞凋亡发生率介于4.10％～19.80％之间,与对照组相比有显著差异(P＜0.05)。随苦参碱浓度的增高,凋亡的发生率也相应增高。
4.线粒体跨膜电位的检测
苦参碱处理MCF-7细胞24h,罗丹明123染色后经流式细胞仪检测。结果显示:苦参碱处理组MCF-7细胞罗丹明染色阳性数(％)明显低于对照组,存在显著差异(P＜0.05),并随苦参碱作用浓度的增高而减少,呈负相关。由此判定苦参碱能够引起MCF-7线粒体跨膜电位显著下降,并随药物浓度的增加而下降程度加大。
5.MCF-7细胞Bax,Bcl-2蛋白表达
苦参碱作用于MCF-7细胞24h和48h后,应用流式细胞术检测Bax、Bcl-2蛋白表达显示,Bax蛋白表达上调,与对照组相比,存在显著差异(P＜0.05),且随作用浓度增高表达增高,呈正相关。Bcl-2蛋白表达,除0.25mg/mL苦参碱作用24h组与对照组比较没有差异性外,其余各药物组与对照组相比均存在显著差异(P＜0.05),且随药物浓度的增加Bcl-2表达降低。
结论:
1.苦参碱对乳腺癌MCF-7细胞有明显的生长抑制作用,呈剂量一效应正相关及时间一效应正相关。苦参碱能够诱导乳癌MCF-7细胞发生凋亡,凋亡率与药物剂量呈正相关。
2.苦参碱诱导乳腺癌MCF-7细胞发生凋亡,其可能的机制是通过某种途经上调Bax基因和下调Bcl-2基因的表达,启动MMP通道开放,使线粒体跨膜电位下降或崩溃,启动凋亡程序,引发细胞凋亡。
3.苦参碱对乳腺癌MCF-7细胞有较为明显生长抑制作用和诱导凋亡作用,可为临床治疗乳腺癌提供一种新的辅助方法。