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空肠弯曲菌是全世界范围内引起细菌性腹泻病的最常见病原菌之一，防治空肠弯曲菌的有效手段主要是抗生素，但是2017年WHO发布指导新型抗生素研发的优先考虑耐药致病菌名单，其中将氟喹诺酮类抗生素耐药的弯曲菌定为二类高度重要病原菌，这说明急迫需要建立对弯曲菌新的防控方法。
本研究中以空肠弯曲菌保守的黏附蛋白Peb1为靶标，通过虚拟筛选生物活性广泛的中药小分子，并构建大肠杆菌表达的重组蛋白rPeb1，制备其单克隆抗体，在此基础上通过体外黏附模型筛选可抑制Peb1黏附的中药小分子，并进行相关的验证实验，以期能够找到抑制空肠弯曲菌黏附侵袭定殖的中药小分子用于空肠弯曲菌的防控。
一、虚拟筛选与空肠弯曲菌黏附蛋白Peb1结合的中药小分子
通过查找蛋白质数据库和同源建模筛选具有可信的三维结构的空肠弯曲菌毒力因子，确定已有晶体结构解析的黏附蛋白Peb1为靶标蛋白。鉴于中药有广泛的生物学活性，选择中医药数据库TCM Database中的4918种类药性小分子为配体库。通过预测活性口袋，比较预测的Cavity与Peb1蛋白自带配体天冬氨酸的空间位置，确定体积较大、中心较深的Cavity_4为本次实验的对接中心。使用Autodock Vina软件进行虚拟筛选，结果显示有4903种小分子可以与Peb1蛋白自发发生反应，且其中亲和力绝对值大于等于6kcal/mol的高评分化合物有3125种，占所有进行虚拟筛选的小分子的63.54％，亲和力绝对值大于等于8kcal/mol的小分子有134种，占所有进行虚拟筛选的小分子的2.72％，将其定为潜在有效小分子进行实验筛选，比常规药物高通量筛选的效率更高，这说明中药小分子确实是值得筛选、深入研究的。
二、空肠弯曲菌黏附蛋白Peb1单克隆抗体的研制
为建立Peb1蛋白体外黏附模型，研制Peb1单抗。将peb1基因分别连入表达载体pColdI和pGEX-6p-1中，构建重组菌BL21(DE3)(pColdI-peb1)和BL21(DE3)(pGEX-6p-1-peb1)。重组菌经IPTG诱导，亲和层析柱纯化后获得表达产物;并通过甘氨酸-盐酸溶液提取空肠弯曲菌含有天然Peb1蛋白的混合蛋白。以纯化蛋白rHis-Peb1为免疫原，rGST-Peb1和含天然Peb1的空肠弯曲菌甘氨酸粗提物为检测原，应用淋巴细胞杂交瘤技术制备Peb1单克隆抗体。通过间接ELISA方法，筛选获得6株稳定分泌抗Peb1蛋白的单克隆杂交瘤细胞株，分别命名为1D6、2A5、3B5、4E1、4F8和5B9，其腹水效价均达到1∶2000000以上，均为IgG1亚类。特异性试验结果显示本研究制备的6株单克隆抗体可特异性识别天然Peb1蛋白，并与空肠弯曲菌的标准株及分离株均有良好的阳性反应，表明6株Peb1单克隆抗体具有良好的反应性，可用于检测Peb1蛋白，这为研究建立空肠弯曲菌病原检测、Peb1功能研究等方面提供了条件。
三、空肠弯曲菌Peb1蛋白黏附抑制剂的验证和评估
为筛选空肠弯曲菌Peb1蛋白的黏附抑制剂，建立了rPeb1对Hela-MEF的体外黏附模型。用3μg/mL Hela-MEF4℃过夜包被受体，1μg/mL黏附素rPeb1提前与中药小分子共孵育后，加入体外黏附ELISA筛选体系中筛选Peb1的黏附抑制剂，确定穗花杉双黄酮可抑制Peb1的黏附，且呈现浓度梯度剂量依赖关系，故选择穗花杉双黄酮进行后续研究。
通过微量肉汤稀释法发现穗花杉双黄酮对空肠弯曲菌的SIC为256μg/mL，趋化实验发现空肠弯曲菌对0.1mM穗花杉双黄酮无趋避现象;通过MTT法确定0.1mM穗花杉双黄酮不影响Hela细胞活性。穗花杉双黄酮对空肠弯曲菌黏附细胞虽无显著性作用但有抑制趋势，并能显著抑制空肠弯曲菌侵袭(p＜0.05)。鉴于黏附作用和Peb1蛋白在空肠弯曲菌生物被膜的关联，同时探究穗花杉双黄酮对空肠弯曲菌生物被膜的影响，发现穗花杉双黄酮可显著性抑制空肠弯曲菌生物被膜的形成，且呈现浓度梯度剂量依赖关系。以上实验结果表明穗花杉双黄酮对防控空肠弯曲菌有一定作用，但仍需要探索更有效的抗黏附或抗毒力化合物进行防控空肠弯曲菌。
本研究中以空肠弯曲菌保守的黏附蛋白Peb1为靶标，通过虚拟筛选生物活性广泛的中药小分子，并构建大肠杆菌表达的重组蛋白rPeb1，制备其单克隆抗体，在此基础上通过体外黏附模型筛选可抑制Peb1黏附的中药小分子，并进行相关的验证实验，以期能够找到抑制空肠弯曲菌黏附侵袭定殖的中药小分子用于空肠弯曲菌的防控。
一、虚拟筛选与空肠弯曲菌黏附蛋白Peb1结合的中药小分子
通过查找蛋白质数据库和同源建模筛选具有可信的三维结构的空肠弯曲菌毒力因子，确定已有晶体结构解析的黏附蛋白Peb1为靶标蛋白。鉴于中药有广泛的生物学活性，选择中医药数据库TCM Database中的4918种类药性小分子为配体库。通过预测活性口袋，比较预测的Cavity与Peb1蛋白自带配体天冬氨酸的空间位置，确定体积较大、中心较深的Cavity_4为本次实验的对接中心。使用Autodock Vina软件进行虚拟筛选，结果显示有4903种小分子可以与Peb1蛋白自发发生反应，且其中亲和力绝对值大于等于6kcal/mol的高评分化合物有3125种，占所有进行虚拟筛选的小分子的63.54％，亲和力绝对值大于等于8kcal/mol的小分子有134种，占所有进行虚拟筛选的小分子的2.72％，将其定为潜在有效小分子进行实验筛选，比常规药物高通量筛选的效率更高，这说明中药小分子确实是值得筛选、深入研究的。
二、空肠弯曲菌黏附蛋白Peb1单克隆抗体的研制
为建立Peb1蛋白体外黏附模型，研制Peb1单抗。将peb1基因分别连入表达载体pColdI和pGEX-6p-1中，构建重组菌BL21(DE3)(pColdI-peb1)和BL21(DE3)(pGEX-6p-1-peb1)。重组菌经IPTG诱导，亲和层析柱纯化后获得表达产物;并通过甘氨酸-盐酸溶液提取空肠弯曲菌含有天然Peb1蛋白的混合蛋白。以纯化蛋白rHis-Peb1为免疫原，rGST-Peb1和含天然Peb1的空肠弯曲菌甘氨酸粗提物为检测原，应用淋巴细胞杂交瘤技术制备Peb1单克隆抗体。通过间接ELISA方法，筛选获得6株稳定分泌抗Peb1蛋白的单克隆杂交瘤细胞株，分别命名为1D6、2A5、3B5、4E1、4F8和5B9，其腹水效价均达到1∶2000000以上，均为IgG1亚类。特异性试验结果显示本研究制备的6株单克隆抗体可特异性识别天然Peb1蛋白，并与空肠弯曲菌的标准株及分离株均有良好的阳性反应，表明6株Peb1单克隆抗体具有良好的反应性，可用于检测Peb1蛋白，这为研究建立空肠弯曲菌病原检测、Peb1功能研究等方面提供了条件。
三、空肠弯曲菌Peb1蛋白黏附抑制剂的验证和评估
为筛选空肠弯曲菌Peb1蛋白的黏附抑制剂，建立了rPeb1对Hela-MEF的体外黏附模型。用3μg/mL Hela-MEF4℃过夜包被受体，1μg/mL黏附素rPeb1提前与中药小分子共孵育后，加入体外黏附ELISA筛选体系中筛选Peb1的黏附抑制剂，确定穗花杉双黄酮可抑制Peb1的黏附，且呈现浓度梯度剂量依赖关系，故选择穗花杉双黄酮进行后续研究。
通过微量肉汤稀释法发现穗花杉双黄酮对空肠弯曲菌的SIC为256μg/mL，趋化实验发现空肠弯曲菌对0.1mM穗花杉双黄酮无趋避现象;通过MTT法确定0.1mM穗花杉双黄酮不影响Hela细胞活性。穗花杉双黄酮对空肠弯曲菌黏附细胞虽无显著性作用但有抑制趋势，并能显著抑制空肠弯曲菌侵袭(p＜0.05)。鉴于黏附作用和Peb1蛋白在空肠弯曲菌生物被膜的关联，同时探究穗花杉双黄酮对空肠弯曲菌生物被膜的影响，发现穗花杉双黄酮可显著性抑制空肠弯曲菌生物被膜的形成，且呈现浓度梯度剂量依赖关系。以上实验结果表明穗花杉双黄酮对防控空肠弯曲菌有一定作用，但仍需要探索更有效的抗黏附或抗毒力化合物进行防控空肠弯曲菌。