论文部分内容阅读
[目的]Survivin是肿瘤特异性凋亡抑制蛋白,在肿瘤形成和维持过程中发挥重要作用,被认为是一种理想的抗癌靶点。然而,近年来开发的Survivin的抑制剂数量有限,这些抑制剂大多通过与其他生物分子相互作用而不是直接与survivin蛋白相互作用来降低Survivin水平。尽管存在这些挑战,开发更有效的、选择性好的Survivin抑制剂对于更好的抑制Survivin抗凋亡的功能和开发潜在的更有效的抗癌药物的研究具有重要意义。因此,本研究针对Survivin蛋白,利用计算机高通量筛选和分子对接等方法,从百灵威天然及半天然多样性小分子数据库中筛选出高亲和力结合Survivin的小分子抑制剂,通过体外实验和体内实验,对其抗胃癌效果进行验证,为开发新的以Survivin为靶点的抗胃癌药物奠定理论基础。[方法]1.虚拟筛选:以Survivin蛋白为靶点,在PDB数据库中确定Survivin蛋白的三维结构,利用薛定谔对接方法,预测Survivin蛋白结合位点并进行分子对接,筛选出对接打分较高(即高亲和力)的小分子化合物。2.小分子化合物与Survivin蛋白实际结合能力验证:将Survivin蛋白固定在CM5芯片表面,采用Biacore X100蛋白互作系统进行SPR检测,观察小分子化合物与Survivin蛋白的实际结合能力。3.体外实验:采用免疫荧光法检测胃癌细胞株SGC 7901和MKN45细胞及人正常胃粘膜上皮细胞GES 1中Survivin蛋白的表达情况;MTT法检测筛选出的2个小分子抑制剂对上述三种细胞株增殖情况的影响;TUNEL染色检测细胞凋亡情况;流式细胞术检测细胞周期;划痕实验检测各组细胞的迁移能力;Transwell小室实验检测各组细胞侵袭能力;Western blot实验检测各组细胞Survivin、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、Cyclin B1、CDK1 蛋白表达情况。4.体内实验:建立人胃癌细胞SGC-7901 BABL/c裸鼠移植瘤模型,随机分为对照组、溶媒对照组和药物干预组;每日观察小分子抑制剂对裸鼠移植瘤生长的影响,并计算抑瘤率;利用HE染色观察各组移植瘤及裸鼠全部脏器的病理学改变;免疫组织化学染色方法检测各组瘤组织中Survivin、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达水平。[结果]1.以 Survivin(PDB ID 4A0I)为靶标,使用Virtual Screening Workflow 工具,从百灵威天然及半天然多样性小分子数据库(http://jkchemical.com/)进行虚拟筛选,通过3轮筛选,共筛选出50个对接打分较高的小分子化合物。再次诱导契合对接,从中选出两个小分子化合物:STOCK1N-52340十一烷基灵菌红素(Undecylprodigiosin,UP)和 N17-X9570-357 马钱子碱(Brucine,BRU)。2.SPR技术验证上述两个小分子与Survivin蛋白的实际结合能力,结果表明小分子抑制剂UP和BRU与Survivin蛋白具有较强的结合能力,与计算机模拟结果一致。3.免疫荧光法检测出胃癌SGC7901和MKN45细胞均明显表达Survivin蛋白,正常胃粘膜上皮细胞GES1中Survivin蛋白无明显表达。4.利用MTT实验检测上述筛选出的2个小分子化合物UP和BRU对SGC 7901细胞和MKN 45细胞的毒性作用,结果表明:小分子抑制剂UP和BRU能够抑制SGC 7901细胞和MKN45细胞生长,呈浓度和时间依赖性(P<0.05)。UP和BRU对GES 1细胞无明显毒性作用。5.TUNEL实验结果表明:UP和BRU作用SGC7901细胞和MKN45细胞48 h后,凋亡细胞数量显著增多,表明UP和BRU均可促进SGC 7901细胞和MKN45细胞的凋亡(P<0.01),对GES 1细胞则无明显作用。6.流式细胞术检测细胞周期结果表明:小分子化合物UP和BRU作用SGC 7901细胞和MKN 45细胞48 h后,均可将细胞周期阻滞在G2/M期,对GES 1细胞则无明显作用。7.划痕实验结果表明:UP和BRU均可以抑制SGC 7901细胞和MKN 45细胞的迁移能力,对GES1细胞则无明显作用;Transwell小室实验结果表明:UP和BRU均可以抑制SGC 7901细胞和MKN 45细胞的侵袭能力,对GES 1细胞则无明显作用。8.对 SGC 7901 细胞和 MKN45 细胞中 Survivin、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、Cyclin B1、CDK1的表达水平进行检测。Western blot结果证实上述两种细胞中Survivin、Bcl-2、CDK1和cyclin B1蛋白表达水平显著下降(P<0.01),Caspase-3、Caspase-9和Bax蛋白表达水平显著增高(P<0.01)。9.胃癌SGC 7901细胞裸鼠异种移植瘤模型,经腹腔注射UP和BRU进行治疗,每日观察移植瘤生长情况,结果表明:UP和BRU干预对裸鼠肿瘤生长具有显著的抑制作用,抑瘤率分别为28.09%和18.47%(P<(0.01)。10.裸鼠移植瘤组织和主要脏器病理学解剖及HE染色观察结果表明:与空白对照组和溶媒组比较,UP和BRU治疗组裸鼠移植瘤生长较慢,UP组和BRU组移植瘤裸鼠心、肝、脾、肺、肾等主要脏器组织形态无明显病理学改变。11.免疫组织化学染色法检测 Survivin、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9蛋白在肿瘤组织中的表达情况,结果表明:与空白对照组相比,UP组和BRU组的 Survivin 和 Bcl-2 蛋白表达显著降低(P<0.01),而 Caspase-3、Caspase-9 和Bax蛋白表达水平显著增高(P<0.01)。[结论]1.计算机高通量筛选和分子模拟对接虚拟筛选出两个具有潜在的生物活性的天然小分子化合物:STOCK1N-52340(UP)和 N17-X9570-357(BRU)。UP和BRU与Survivin蛋白的实际结合能力与计算机模拟的结果相一致。2.UP和BRU对两种人胃癌细胞株均具有显著的增殖抑制作用,这与计算机模拟预测的结果相一致。UP和BRU能显著抑制裸鼠人胃癌细胞异种移植瘤的生长,并且模型裸鼠各脏器形态无明显病理改变。3.经体外、体内实验验证。UP和BRU具有抗胃癌活性,其可能的机制与诱导肿瘤细胞凋亡和细胞周期阻滞有关。UP和BRU具有高选择性和高亲和力等优点,具备可开发潜力和价值。