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乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一,其发病率、死亡率分别位居全球女性恶性肿瘤的第一及第五位。其中,雌激素受体(ER)阳性乳腺癌患者占据了患者总数的60-70%。虽然内分泌治疗对大部分ER阳性患者有效,但由于其耐药现象及不良反应的存在,我们有必要寻找新型治疗靶点。水通道蛋白3(AQP3)是AQP家族中的重要成员,它的主要功能是参与水及甘油的跨膜转运。近年来,AQP3被报道在多种肿瘤细胞中表达升高,其中包括乳腺癌。然而,关于AQP3在乳腺癌组织中高表达的原因及是否存在临床意义尚未有深入的研究。为了探寻AQP3在ER阳性乳腺癌发生、发展中的作用,我们首先观察了AQP3在乳腺癌中的表达情况及其临床意义。荧光定量PCR结果显示,AQP3在乳腺癌组织中的表达明显高于其自身癌旁正常织组。ER阳性乳腺癌切片的免疫组化结果显示,AQP3的高表达可能提示着癌细胞更高的恶性程度。同时,免疫组化结果也显示,绝经前患者乳腺癌细胞中的AQP3表达水平显著高于绝经后患者中的。在此基础上,我们进一步研究E2对ER阳性乳腺癌中AQP3的调节作用及其作用机制。体外细胞实验结果显示,E2可以上调ER阳性乳腺癌细胞中AQP3的表达。这种上调作用是剂量依赖的,且可以被ER阻断剂阻断。染色质免疫共沉淀实验及荧光素报告酶实验结果显示,E2-ER复合物可以通过结合AQP3基因启动子区域的雌激素受体反应元件直接上调AQP3的表达。通过siRNA干扰技术我们发现,AQP3敲降后,E2介导的ER阳性乳腺癌细胞的迁移及侵袭行为显著减弱。过表达实验显示,AQP3表达上调后,细胞的迁移及侵袭能力显著增强。由此推测,在ER阳性乳腺癌细胞中,E2可以通过直接上调AQP3的表达来促进细胞的迁移及侵袭。进一步研究发现,AQP3表达升高会影响上皮间质转换(EMT)相关分子的表达,促进微丝骨架重构并形成丝状伪足,从而促进细胞的迁移和侵袭。综上所述,ER阳性乳腺癌细胞中,E2能够直接上调AQP3的表达；而AQP3上调导致的EMT相关分子表达水平的改变及微丝骨架的重构,能促进细胞的迁移和侵袭。本文通过对AQP3在ER阳性乳腺癌发病机制中的研究,初步揭示了AQP3高表达与ER阳性乳腺癌病理分级、淋巴转移等临床特征相关,证明了E2上调AQP3的机制及AQP3在E2介导的乳腺癌迁移及侵袭中的作用。上述结果初步证明了ER阳性乳腺癌发生、发展中一种新的作用机制,为乳腺癌的基础及临床研究提供了科学依据,也为乳腺癌治疗提供了新的潜在性靶点。第一部分AQP3在ER阳性乳腺癌组织中的表达情况及临床意义目的：观察AQP3在人乳腺癌组织上的表达情况。探讨ER阳性乳腺癌组织中AQP3表达水平与患者临床特征间的关系。方法：1.采用荧光定量PCR的方法对20例乳腺癌患者的乳腺癌组织及其癌旁正常组织进行AQP3 mRNA水平的检测。2.采用免疫组化技术检测AQP3在56例ER阳性乳腺癌组织切片中的表达及定位。结果：1.AQP3在乳腺癌组织中的表达量显著高于其自身癌旁正常组织中的。2.ER阳性乳腺癌患者中,AQP3在高病理分级、淋巴结转移阳性及乳癌晚期的乳腺癌中的表达量分别高于低病理分级、淋巴结转移阴性及乳癌早期的乳腺癌中的。3.ER阳性乳腺癌患者中,绝经前患者乳腺癌细胞中的AQP3表达水平显著高于绝经后患者乳腺癌细胞中的。结论：ER阳性乳腺癌细胞中,AQP3表达升高可能提示肿瘤更高的恶性程度。第二部分E2通过雌激素受体反应原件直接调控ER阳性乳腺癌细胞中AQP3的表达目的：探讨乳腺癌中,E2是否具有调节AQP3表达的作用及其调节机制。方法：1.用E2和／或ER受体阻断剂ICI182780处理ER阳性乳腺癌细胞,采用荧光定量PCR及Western Blot的方法检测AQP3表达水平的改变。2.利用RSAT调控序列分析工具分析AQP3基因启动子区域序列中潜在的ERE。3.利用染色质免疫共沉淀实验及荧光素报告酶实验检测潜在ERE的功能。结果：1.E2能够显著上调ER阳性乳腺癌细胞中AQP3的表达。这种上调作用呈剂量依赖性,且可以被ER阻断剂ICI1821780阻断。2.AQP3基因启动子区存在有功能的ERE。E2可通过ER直接作用于AQP3启动子区的ERE,从而上调ER阳性乳腺癌中AQP3的表达。结论：我们首次发现AQP3基因启动子区存在有功能的ERE。在ER阳性乳腺癌中,E2能通过基因组转录途径直接上调AQP3的表达。第三部分AQP3通过影响EMT相关分子的表达及微丝骨架的重构来实现E2介导的细胞迁移和侵袭目的：探讨AQP3在E2介导的ER阳性乳腺癌发生、发展中的作用。方法：1.采用MTT法研究ER阳性细胞中,AQP3在E2介导的细胞增殖中的作用。2.采用划痕实验研究ER阳性细胞中,AQP3在E2介导的细胞迁移中的作用。3.采用Transwell法研究ER阳性细胞中,AQP3在E2介导的细胞侵袭中的作用。4.罗丹红-鬼笔环肽染色,激光共聚焦观察AQP3对细胞微丝骨架形态的影响。5.采用荧光定量PCR技术研究,AQP3上调后对上皮间质转化(EMT)相关分子表达的影响。结果：1.E2能够促进ER阳性乳腺癌细胞的迁移、侵袭及增殖。AQP3敲降后,E2介导的细胞迁移和侵袭行为显著减弱,但增殖行为无明显变化。2.E2能影响ER阳性乳腺癌细胞微丝骨架的重构,使细胞更易于迁移和侵袭。AQP3敲降后,E2对微丝骨架重构的影响显著减弱。3.AQP3过表达后,乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力显著增强,但增殖能力无明显变化。4.AQP3过表达后,乳腺癌细胞的微丝骨架发生重构,且EMT相关分子的表达水平发生显著改变,使细胞更易于迁移和侵袭。结论：ER阳性乳腺癌中,E2上调AQP3对细胞迁移和侵袭能力的增强是通过影响EMT相关分子的表达和微丝骨架的重构实现的。