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目的:血管钙化是由细胞和分子参与的、类似于骨形成的主动过程。当调节血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)分化的信号系统出现紊乱时,VSMCs维持增殖表型或向成软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞等间质细胞系转化,导致动脉粥样硬化、血管钙化等血管性疾病,因此,VSMCs是联系骨代谢和血管钙化的细胞学基础之一。深入研究VSMCs钙化的发病机制,预防、延缓或逆转细胞钙化的发生,具有重要的临床意义。
钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN)是丝/苏氨酸蛋白磷酸酶家族成员,属于PP2B家族,是唯一受Ca2+/钙调素调节的磷蛋白磷酸酶。CaN组织分布广泛,使底物NFATs去磷酸化而易位入核,激活下游基因转录,参与多种细胞功能的调节。研究证实CaN在多个系统内产生各种生物学效应、分泌各种细胞因子。CaN不但参与成骨细胞及破骨细胞分化、成骨作用,而且还在VSMCs增殖及功能维持中起到重要作用,是否参与VSMCs钙化的调节过程,目前国内外尚未见有报道。
研究表明,高磷能以时间和剂量依赖性方式诱导VSMCs钙化。本试验采用高磷培养基培养大鼠VSMCs,建立大鼠VSMCs钙化模型,测定VSMCs中CaNB mRNA、蛋白质的表达及CaN活性,VSMCs中Ca2+定量,碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性,并观察CaN特异性抑制剂环孢霉素A(cyclosporinA,CsA)对CaN表达及对VSMCs钙化的影响,初步探讨CaN对大鼠VSMCs钙化的调节作用,为VSMCs钙化的临床防治提供新的思路。
方法:大鼠VSMCs(A7r5)1株(购于中国科学院细胞库),经传代培养后,随机分为3组,A组:对照组;B组:钙化组:C组:钙化+CsA组简称CsA组。细胞培养至长满瓶底,测细胞密度为106/mm2,A组给予正常对照的培养基,B组给予磷酸二氢钠配制的(2mmol/l)培养基,C组给予磷酸二氢钠配制的2mmol/l的DMEM培养基同时加入5ug/ml的CsA,分别培养6天,每3天换液一次,于第6天收集细胞。
将收集的各组细胞Westem Blot测定CaNB蛋白、实时荧光定量反转录PCR法测定CaNB mRNA、ELISA法测定VSMCs的Ca2+活性及CaN活性、比色法测定ALP活性、光镜下观察茜素红染色大鼠VSMCs钙化的情况。所有数据均以均数±标准差(x-±s)表示,运用SPSS17.0统计软件,对计量资料进行正态性检验及方差齐性检验,组间资料比较应用单因素方差分析,两两比较应用LSD-t检验,P＜0.05即有统计学意义。
结果:(1)茜素红染色结果示对照组大鼠VSMCs呈梭形,排列整齐,未见钙化点;钙化组大鼠VSMCs呈梭形或多角形,排列紊乱,可见大量褐色钙化点;CsA组大鼠VSMCs呈梭形或多角形,排列紊乱,也可见大量褐色钙化点。(2)ELISA法测定大鼠VSMCs CaN活性表达结果为钙化组(21.47±1.86IU/L)较对照组(14.31±0.24IU/L)表达显著增加(P＜0.01),CsA组(15.34±0.14IU/L)较对照组(14.31±0.24IU/L)表达显著增加(P＞0.05),无统计学意义,与CsA抑制CaN活性有关,但较钙化组(21.47±1.86IU/L)表达也显著增加(P＜0.01),有统计学意义。(3)ELISA法测定大鼠VSMCs Ca2+定量分析结果为钙化组(9.01±0.32pg/ml)较对照组(6.03±0.33pg/ml)Ca2+定量显著增加(P＜0.01),CsA组(10.39±0.70pg/ml)较对照组(6.03±0.33pg/ml)Ca2+定量也显著增加(P＜0.01),且较钙化组(9.01±0.32pg/m1)Ca2+定量显著增加(P＜0.05),有统计学意义。(4)实时荧光定量反转录PCR法测定CaNB mRNA表达结果为钙化组CaNB mRNA表达(6.27±1.45)较对照组(1.10±0.28)显著增加(P＜0.01);CsA组(3.38±0.77)较对照组(1.10±0.28)表达显著增加(P＜0.01),而较钙化组(6.27±1.45)表达显著减少(P＜0.01),有统计学意义。(5)Western blot测定CaN B蛋白定量结果为钙化组CaNB表达(69.11±2.51)较对照组(29.9±1.39)显著增加(P＜0.01);CsA组(48.22±2.47)较对照组(29.9±1.39)表达显著增加(P＜0.01),而较钙化组(69.11±2.51)表达显著减少(P＜0.01),有统计学意义。(6)用比色法测定细胞内ALP活性结果为钙化组的ALP活性(146.04±9.02U·g-1protein)较对照组(38.74±2.23 U·g-1protein)显著增高(P＜0.01);CsA组(216.69±14.00 U·g-1protein)较对照组(38.74±2.23 U·g-1 protein)也显著增高(P＜0.01),且较钙化组(146.04±9.02 U·g-1protein)显著增高(P＜0.01)。
结论:1.本实验采用高磷培养VSMCs成功地建立了大鼠VSMCs钙化模型,并且在光镜下观察了钙化大鼠VSMCs的结构变化。2.本试验首次发现钙化组大鼠VSMCs中CaN B mRNA和蛋白的表达和CaN活性较对照组显著增加,而Ca2+定量及ALP活性相对于CsA组却显著减少,说明CaN很可能参与VSMCs钙化的调节过程。3.免疫抑制剂CsA可能促进VSMCs钙化。