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背景与目的糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy,DR)是糖尿病的微血管并发症,也被认为是一种慢性低度炎症性疾病。在糖尿病的早期阶段,DR的特征是视网膜屏障(the blood-retinal barrier,BRB)的破坏,而组成内层视网膜屏障的主要部分是内皮细胞,并且随着糖尿病病程的延长,内皮细胞死亡数目增加。除内皮细胞死亡外,炎症介质也会通过激活细胞内信号增加血管通透性。炎症因子白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)的水平在糖尿病患者和动物模型的视网膜、玻璃体和血清中升高,还能以旁分泌和自分泌的方式诱导自身的合成,加速并扩大糖尿病视网膜中的炎症级联反应。叉头状转录因子O1(Forkhead transcription factor,Fox O1)是叉头状转录因子O亚家族中重要的一员,在调控增殖凋亡、氧化应激、调节自噬和分化等方面发挥重要作用。研究发现,在1型和2型糖尿病大鼠模型的视网膜中,Fox O1的活性增加,并伴随着炎症反应和凋亡增加。因此推测DR状态下Fox O1活性增加可能与炎症有一定的联系,但Fox O1调节内皮细胞功能的具体机制尚不清楚。研究发现,在原代大鼠肝细胞和HEK293细胞中,IL-1β通过刺激IL-1受体过表达导致胞质和核内Fox O1蛋白量增加。而在巨噬细胞中,Fox O1直接结合到IL-1β启动子上,促进IL-1β的表达增加。因此推测,IL-1β在视网膜内皮细胞中可刺激Fox O1表达增加,从而促进IL-1β的表达增加。本实验以Fox O1特异性小干扰RNA(si RNA)慢病毒载体下调内皮细胞和STZ诱导的糖尿病大鼠视网膜中的Fox O1的表达及活性,观察Fox O1在IL-1β诱导的自刺激中的作用,并探讨其机制。方法原代人视网膜血管内皮细胞(HRMECs)培养于不同糖浓度(5.6、15、25、35mmol/L)24h后,实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和Western blotting法检测Fox O1、IL-1β的表达。HRMECs培养于重组人白介素-1β(r IL-1β)的不同浓度(0、1、2.5、10、25、100ng/m L)24h后,Real-time PCR、Western blotting检测处理后细胞的Fox O1、IL-1β、Caspase-8表达,细胞免疫荧光检测处理后细胞中Fox O1的表达分布,流式细胞仪检测不同浓度r IL-1β处理后HRMECs的凋亡率。HRMECs培养于IL-1受体阻断剂(IL-1RA)、MAPK阻断剂(U0126、SB203580、SP600125)中伴或不伴r IL-1β(10ng/m L),Western blotting法检测Fox O1、p-ERK、p-P38、p-JNK的表达。将构建的Fox O1特异性小干扰RNA(si RNA)慢病毒载体及空慢病毒载体(LV-NC)转染于正常培养的HRMECs,转染后的细胞经或不经过r IL-1β(10ng/m L)刺激24h后,Real-time PCR、Western blotting法检测Fox O1、IL-1β的表达。40只SPF级雄性SD大鼠,随机选取其中30只构建糖尿病大鼠模型,10只作为正常对照组(NC组)。糖尿病造模成功后,将成模糖尿病大鼠随机分为3组:糖尿病组(DM组),糖尿病Fox O1干扰转染组(LV-si-Fox O1组)和糖尿病空病毒转染组(LV-NC组)。大鼠麻醉后,在解剖显微镜下玻璃体注射Fox O1特异性小干扰RNA(si RNA)慢病毒载体及空慢病毒载体(LV-NC)10μl,涂抹抗生素软膏以保护角膜。于病毒注射后4周、8周、12周末,称体重(Body Weight,BW),尾静脉取血测血糖。12周末水合氯醛麻醉大鼠,迅速剥离出眼球,置于4%多聚甲醛中固定用于HE染色和免疫组化检查,于4%预冷戊二醛固定用于电子显微镜检查。新鲜眼球,去除眼前节,分离出视网膜,迅速于液氮中冷冻,荧光定量PCR和Western bloting检测Fox O1、IL-1β表达。结果1.高糖诱导HRMECs的Fox O1和IL-1β表达增加:Fox O1和IL-1β蛋白和m RNA的表达水平随着葡萄糖浓度的增加而增加,特别是糖浓度在35mmol/L时候显著升高(P<0.05)。2.r IL-1β诱导HRMECs的早期凋亡是浓度依赖性,但并不依赖Caspase-8的表达:正常培养的HRMECs早期凋亡率是0.5%,而培养于不同浓度(1、2.5、10、25、100ng/m L)的r IL-1β后,凋亡率分别增加为5.3%,6.6%,8.1%,8.3%,12.6%。不同浓度的r IL-1β对HRMECs的Caspase-8蛋白表达水平无明显影响(P>0.05)。3.不同浓度r IL-1β诱导HRMECs的Fox O1和IL-1β表达增加:与对照组相比,Fox O1和IL-1βm RNA及蛋白的表达水平随着r IL-1β浓度的增加而明显增加(均P<0.05);细胞免疫荧光化学提示随着r IL-1β浓度的增加,Fox O1在细胞核内和胞质内的表达增加,在r IL-1β浓度为25和100ng/m L时,表达显著增加(P<0.05)。4.IL-1受体阻断剂(IL-1RA)、MAPK阻断剂(U0126、SB203580、SP600125)减少r IL-1β诱导HRMECs的Fox O1表达:IL-1RA可减少r IL-1β诱导HRMECs的Fox O1和IL-1β表达。r IL-1β可激活细胞的磷酸化MAPK(p-ERK、p-P38、p-JNK),而IL-1RA可以阻断r IL-1β诱导的MAPK的磷酸化。另外,MAPK阻断剂也可抑制r IL-1β诱导的Fox O1蛋白表达。5.LV si-Fox O1慢病毒转染细胞后,r IL-1β诱导转染细胞的Fox O1和IL-1β表达减弱:HRMECs为原代细胞,流式检测转染组和空载组的转染效率分别是68.1%和58.5%。与正常组相比,IL-1β组和LV-NC+IL-1β组Fox O1和IL-1β表达都明显增加(P<0.001);与10ng/ml r IL-1β组相比,r IL-1β+LV si-Fox O1组Fox O1的m RNA表达水平降低,但仍有统计学意义(P<0.05),而r IL-1β+LV si-Fox O1组IL-1β的m RNA水平则显著降低(P<0.001)6.在大鼠视网膜中,慢病毒转染可下调Fox O1和IL-1β表达:与NC组相比,DM组Fox O1和IL-1β蛋白和m RNA表达水平显著增加(P<0.05),而LV-si-Fox O1组Fox O1和IL-1β表达无统计学意义(P>0.05)。免疫组化结果显示,DM组Fox O1和IL-1β免疫染色较NC组显著增加,LV-si-Fox O1组免疫染色则不显著,Fox O1免疫染色主要分布外网状层、内核层、内网状层和神经节细胞层,IL-1β免疫染色在视网膜全层表达增加。电镜结果显示正常组内皮细胞线粒体形态正常,官腔未变形。DM组和LV-NC组内皮细胞线粒体明显肿胀,可见空泡变性,管腔明显狭窄。LV-si-Fox O1组内皮细胞线粒体轻度肿胀,官腔未见明显变形。结论1.在HRMECs中IL-1β通过IL-1受体激活MAPK,并促进Fox O1表达,进而上调IL-1β。2.在糖尿病大鼠视网膜中,下调Fox O1的表达可降低视网膜IL-1β的表达,减轻视网膜炎症。