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目的:从天然环境中筛选高胆固醇氧化酶活性的菌株,对其进行鉴定,分离酶基因,将其体外基因重组并进行蛋白质工程修饰,以提高酶活性。方法:(1)以胆固醇为唯一碳源,初筛含胆固醇氧化酶的菌株。将菌株接种到液体养基中进行恒温培养,对培养液上清进行硅胶薄层层析检测。选取有明显新产物斑点产生的培养液进行气相色谱-质谱检测,筛选高胆固醇氧化酶活性的菌株。通过试剂盒提取得到菌株的基因组,并进行16SrDNA序列比对,确定菌株种属。(2)选择一株菌株进行培养,细胞破碎后进行盐析、弱阴离子交换层析、疏水层析和分子筛层析,得到胆固醇氧化酶纯品。通过Edman法和羧肽酶法测得该酶氨基酸链两端的残基序列,在数据库中比对得到编码基因序列。基因通过聚合酶链式反应扩增、重组和转化导入E.coliTop10细胞并表达,对其产物进行纯化。(3)测定酶的最适pH、最适温度、有机溶剂耐受性以及底物谱等理化性质。(4)制作酶的三维模型,并与底物分子对接,根据模型选择位点进行饱和突变和表达。纯化突变体的高胆固醇氧化酶并测定其理化性质。结果:通过筛选得到了 3株高效菌株,鉴定结果分别为Cellulosimicrobium,Stenotrophomonas sp.和 Arthrobacter sp.,选择 Arthrobacter sp.为研究对象,并得到胆固醇氧化酶。该酶最适pH为7,最适温度为40℃,在最适条件下Km为1.41mM/L,酶活力为94.7U/mg。其对N,N-二甲基甲酰胺、甲醇和二甲基亚砜表现出良好的有机溶剂耐受性。其可转化的底物包括胆固醇、β-谷甾醇、孕烯醇酮和手性化合物3,5,5-三甲基-2-环己烯-1-醇等,其中对3,5,5-三甲基-2-环己烯-1-醇几乎没有手性选择性。根据三维对接模型选择了底物结合口袋中的Glu144,Gly160和Asn164位点进行饱和突变。其中Glu144位点变为Tyr后该酶对底物3,5,5-三甲基-2-环己烯-1-醇的催化活性可以提高5倍,且对底物的手性选择性达到9.8%;Glu144位点变为Met后可使该酶对底物的手性选择性达到14.92%;Gly160位点突变为Thr后该酶对底物胆固醇的催化活性可提高565.77%。结论:筛选出含胆固醇氧化酶的菌株,并得到其编码基因,且成功对其进行克隆,得到表达产物并进行纯化和其理化性质分析。对该酶进行饱和突变改造,有效地提高了对特定底物的活性,提高了对底物的立体结构选择性。