本论文研究工作为国家自然科学基金资助项目—“归-红花配伍养血活血量效关系与协同增效相互作用研究”的部分实验内容。论文共分为五章,第一章系统地综述了中药配伍相互作用研究方法与进展。第二章到第五章为实验部分,具体研究内容和相关结论如下：第二章实验用样品的制备基于对中医方剂数据挖掘结果和统计分析需要,选择7个不同配比当归-红花(4：1、2：1、3：2、1：1、2：3、1：2、1：4)及当归、红花单味药,按比例称取酒当归和红花,混合,共4.5 kg,以上样品采用热回流水提法进行提取,得制备样品为DG、GH4:1、GH21、GH3:2、GHl:1、GH2:3、GH1:2、GH1:4、HH,冷藏备用。第三章当归-红花不同量比养血活血效应比较研究第一节当归-红花不同剂量的养血补血作用的比较研究观察当归、红花两药昧不同配比对血虚小鼠的补血作用差异,优选当归-红花配伍补血作用的最佳配比。采用乙酰苯肼与环磷酰胺联合造模法复制小鼠血虚模型。基于多指标综合指数法,首先以《中医方剂大辞典》数据库中出现频次最高的当归-红花1：1配比为代表,优选当归、红花配伍补血作用的最佳浓度；然后采用优选的最佳浓度来观察当归、红花不同配比的补血作用变化规律。结果发现,在5个不同浓度(分别为当归、红花临床等效量的1、2、3、4、5倍)下,当归-红花剂量为临床等效量时的总补血效应最好；在当归、红花的9个不同配比(1：0、4：1、2：1、3：2、1：1、2：3、1：2、1：4和0：1)中,以当归-红花1：1的总补血效应最好。该结果与中医方剂中使用当归、红花1：1频次最高的用药规律相一致,为现代临床更有效应用当归与红花提供了科学依据。第二节当归-红花不同剂量的活血化瘀作用比较研究联合应用冰水浴和皮下注射盐酸肾上腺素,复制大鼠血瘀模型,通过测定全血黏度、血浆黏度、全血高切相对指数、全血低切相对指数、红细胞聚集指数,观察当归-红花配伍对血瘀大鼠血液流变学的影响；然后采用多指标综合指数法综合评价当归-红花配伍的总活血化瘀效应。结果显示,与正常组相比,模型组各指标均具有显著性差异；不同浓度的当归-红花提取液均能较好的改善急性血瘀大鼠的血液流变学各指标。采用多指标综合指数法综合评价不同浓度的当归-红花提取液的总活血化瘀效应值大小顺序为：GH3> GH1> GH4>GH2>GH5。以上结果说明,不同浓度的当归-红花提取液对血瘀大鼠均有一定的活血化瘀作用,其中以GH3的活血化瘀效果最优,及当归、红花配伍比例为1：1时,浓度为临床用药剂量的3倍量时活血化瘀效果最好。第三节当归-红花不同配比的活血化瘀作用比较研究为了比较评价当归-红花(GH)不同配比对急性血瘀大鼠血液流变学和凝血功能的影响,优选当归-红花配伍活血作用的最佳配比。本实验采用皮下注射盐酸肾上腺素和冰水游泳共同复制急性血瘀大鼠模型,通过测定全血黏度、血浆黏度、全血高切相对指数、全血低切相对指数、红细胞聚集指数,观察当归-红花配伍对血瘀大鼠血液流变学的影响；通过测定凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、血浆纤维蛋白原(FIB)含量及血小板最大聚集率(ADP),观察当归-红花配伍对血瘀大鼠凝血功能及血小板聚集的影响。然后采用主成分分析法和多指标综合指数法综合评价当归-红花配伍的总活血化瘀效应。结果显示,与正常组比较,模型组各血液流变学指标和凝血功能指标均有显著性差异；与模型组比较,当归-红花7个不同配比(4：1、2：1、3：2、1：1、2：3、1：2、1：4)组及单味药(DG、HH)组均能较好的改善急性血瘀大鼠的血液流变学各指标,对凝血功能多个指标也有较好的调节作用。主成分分析法和多指标综合指数法综合评价得出,当归-红花配比1：1和3：2的活血化瘀作用最好,其中1：1的活血化瘀作用更优于3：2。以上结果说明,当归-红花配伍能明显改善血瘀大鼠的血液流变学及凝血功能异常,且当归-红花活血化瘀作用的最佳配比与临床中医方剂中使用当归、红花1：1频次最高的结论相一致,为临床更有效应用当归-红花配伍提供了科学依据。第四节当归-红花的抗氧化量效关系研究采用DPPH、ABTS、OH-自由基清除法及FRAP法,比较当归-红花不同配比不同剂量组的抗氧化能力。结果显示,当归-红花配比相同剂量不同时,高剂量组(100 mg/mL)对DPPH、ABTS、OH自由基有较强的清除率,对Fe3+有较强的还原作用,且对DPPH、ABTS自由基的清除率及对Fe3+的还原作用呈一定的量效关系。第五节当归-红花的抗凝血量效关系研究本实验分别研究了当归-红花(GH)不同配比不同剂量组对ADP诱导的血小板聚集的影响及对TT、PT、APTT的延长作用、对FIB含量的降低作用。结果表明,与空白组比较,除当归组外,其他各组对ADP诱导的血小板聚集率有显著降低作用,且呈一定的量效关系；与空白组比较,各配比高剂量组(0.50 g/mL)对PT均有显著延长作用,且除了GH1 :2、GH2:3、GH2:1组外,其他各组均呈现一定的量效关系；与空白组比较,各配伍组对TT的延长作用呈现一定的剂量关系；实验各组对新西兰大耳白兔体外血浆中FIB的含量均有显著降低作用,且相同配比不同剂量组间呈现一定的量效关系。第四章当归-红花配伍在血虚／血瘀大鼠体内的代谢产物比较研究第一节当归-红花配伍在血虚大鼠体内的代谢产物比较研究采用UHPLC-QTOF/MS联用技术,通过能量梯度(MSE)和质量亏损过滤(MDF)方法,对灌胃给药归红药对及其组成药味提取物后血虚大鼠血浆、尿液和胆汁中阿魏酸、咖啡酸、羟基红花黄色素A和6-羟基山奈酚3-O-β-D葡萄糖苷4种效应成分的代谢转化特征进行分析。共鉴定得到阿魏酸代谢产物9个,血浆中3个,尿液中9个,胆汁中4个；主要为去羰基、还原、甲基化、水合、二次甲基化、甲基化加水合、乙酰化、硫酯化、一分子葡萄糖醛酸结合代谢产物。咖啡酸代谢产物9个,血浆中5个,尿液中6个,胆汁中8个；主要为还原、甲基化、水合、二次甲基化、乙酰化、硫酯化、甲基化加硫酯化、一分子葡萄糖醛酸结合、甲基化加一分子葡萄糖醛酸结合代谢产物。羟基红花黄色素A代谢产物8个,血浆中3个,尿液中7个,胆汁中3个；主要为甲基化、羟基化、水合、乙酰化、硫酯化、甘氨酸结合、牛磺酸结合、一分子葡萄糖醛酸结合代谢产物。6-羟基山奈酚3-O-β-D葡萄糖苷代谢产物6个,血浆中2个,尿液中5个,胆汁中4个；主要为脱C6H120,、乙酰化、甲基化、脱C6H1205加乙酰化、脱C6H1205加一分子葡萄糖醛酸结合、脱C6H1205加两分子葡萄糖醛酸结合代谢产物。结果说明,归红药对及其组成药味提取物中主要有效成分在血虚大鼠体内存在多种Ⅰ相和Ⅱ相代谢产物,为阐明该药对及其组成药味在体内发挥疗效的功效物质基础提供依据。第二节当归-红花配伍在血瘀大鼠体内的代谢产物比较研究采用UHPLC-QTOF/MS联用技术,通过能量梯度(MSz)和质量亏损过滤(MDF)方法,对灌胃给药归红药对及其组成药味提取物后血瘀大鼠血浆、尿液和胆汁中阿魏酸、绿原酸、羟基红花黄色素A和对香豆酸4种效应成分的代谢转化特征进行分析。共鉴定得到阿魏酸代谢产物12个,血浆中5个,尿液中11个,胆汁中5个；主要为脱去羰基、还原、甲基化、水合、二次甲基化、甲基化加水合、硫酯化、甘氨酸结合、一分子葡萄糖醛酸结合、牛磺酸结合、谷胱甘肽结合、硫酯化加一分子葡萄糖醛酸结合代谢产物。绿原酸代谢产物11个,血浆中5个,尿液中10个,胆汁中9个；主要为脱C7H10O5、脱C7H10O5加还原加氢、脱C7H10O5加乙酰化、脱C7H10O5加水合、脱C7H10O5加一分子葡萄糖醛酸结合、还原加氢、水合、甲基化、羟基化、乙酰化、甲基化加半胱氨酸结合代谢产物。羟基红花黄色素A代谢产物7个,血浆中4个,尿液中6个,胆汁中2个；主要为甲基化、羟基化、水合、还原加氢、乙酰化、甘氨酸结合、一分子葡萄糖醛酸结合代谢产物。对香豆酸代谢产物9个,血浆中4个,尿液中9个,胆汁中3个；主要为去羰基、脱还原加氢、水合、甲基化、硫酯化、硫酯化加一分子葡萄糖醛酸结合、甘氨酸结合、牛磺酸结合、葡萄糖醛酸结合代谢产物。结果说明,归红药对及其组成药味提取物中主要有效成分在血瘀大鼠体内存在多种I相和II相代谢产物,为阐明该药对及其组成药味在体内发挥疗效的功效物质基础提供依据。第五章基于代谢组学的当归-红花养血活血作用机理研究第一节基于代谢组学的当归-红花养血补血作用机理研究采用乙酰苯肼和环磷酰胺复合法复制大鼠血虚模型,将大鼠分为模型组、正常组、当归组、红花组、归红组,运用超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF/MS)技术,对各组大鼠尿液与血浆中内源性代谢物进行测定,采用监督模式识别方法正交信号校正结合偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)对多变量数据进行分析,t检验方法进行显著性统计分析。结果表明,模式识别中模型组大鼠能较好地与其他组分开；进一步从模型组大鼠尿液及血浆代谢图谱中定性鉴定出犬尿氨酸、苯丙氨酸、烟酸、鞘氨醇、异亮氨酸、酪氨酸和5-羟色胺潜在代谢生物标志物,这些内源性物质在各给药组大鼠体内得到了不同程度的恢复,通过独特通路分析,找到了苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成,缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的生物合成,色氨酸代谢和酪氨酸代谢等多条血虚证代谢通路。以上结果显示,归红药对对血虚大鼠的治疗作用可能与10个血虚证代谢通路的调节有关,代谢组学在中药的疗效和机制研究中是一种很有前途的工具。第二节基于代谢组学的当归-红花活血化瘀作用机理研究联合采用冰水浴以及注射盐酸肾上腺素复制急性血瘀大鼠模型,将大鼠分为正常组、模型组、当归组、红花组、归红组,运用超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF/MS)技术,对各组大鼠尿液及血浆中内源性代谢物进行分离鉴定,采用偏最小二乘-判别分析法(PLS-DA)、正交偏最小二乘-判别分析法(OPLS-DA)分析不同组大鼠尿液及血浆中的差异性代谢物,寻找潜在代谢标记物,发掘相关代谢通路。结果发现,模式识别中模型组大鼠能较好地与其他2组分开。与正常组大鼠相比,模型组中精氨酸、琥珀酸、氨基己二酸、色胺、肌酸、血栓素A2和花生四烯酸含量升高,亚精胺、鸟氨酸、山梨糖醇、苯基丙酮酸、植物鞘氨醇、苯乙酸和神经酰胺(d18：1/16：0)的含量降低,提示这14种内源性物质为血瘀模型大鼠的潜在生物标志物。通过代谢通路分析,找到4条主要的血瘀证代谢通路,分别是苯丙氨酸代谢、鞘脂类代谢、花生四烯酸代谢和精氨酸和脯氨酸代谢。结果显示,这些内源性物质在给药组大鼠体内得到了不同程度的恢复,且归红组效果最明显,反映了当归和红花之间的协同作用。本研究通过分析大鼠急性血瘀模型以及给予归红药对后大鼠尿液及血浆的代谢组学变化,结合模式识别的统计分析方法,探讨冰水浴以及注射盐酸肾上腺素复合法所致血瘀证的内源性作用机制,及归红药对对异常代谢的调节作用,寻找归红药对治疗急性血瘀证可能的代谢生物标志物,为中药经典药对的作用机制研究提供科学依据。