背景阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是常见的神经退行性疾病之一,AD的发病原因还不十分清楚,近年来,其发病率不断增加,老龄可能是其重要诱发因素。目前研究表明,老年痴呆中阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)发病率高达50%-60%,严重影响了老年人的身体健康和正常的生活。AD已成为当前老年医学研究中的难题之一。随着医学技术水平的不断提高,人均寿命相应延长,高龄患者的疾病治疗过程中,手术和麻醉的应用愈加广泛,全身麻醉对AD患者影响作用越来越受到人们的重视,成为麻醉学领域研究的热点方向之一。动物研究表明,吸入麻醉能够促进β-淀粉样蛋白(beta-amyloid protein,Aβ)的聚集和神经原纤维缠绕,引起神经细胞凋亡。有流行病学调查和研究发现,全身麻醉药使AD患病率明显上升。全身麻醉已成为术后认知功能障碍和AD的一个潜在的危险因素。有队列研究结果则表明:手术和全身麻醉能够增加阿尔兹海默病的发病率,但Dallas等人所做的针对麻醉与AD发病率相关性研究的荟萃分析发现,尽管还缺高质量的和长期的跟踪随访研究,但就目前的研究结果来看,全麻手术病史并不增加患阿尔兹海默病的风险。七氟醚是临床上广泛使用的吸入麻醉药。体外试验发现,将过度表达APP的人类H4神经胶质细胞暴露在4.1%的七氟醚中6小时,能引起细胞凋亡,同时改变APP进程,增加Aβ的聚集。动物研究表明,七氟醚对小鼠正常脑组织和孕鼠具有神经毒性,能够诱导神经细胞凋亡和促进β-淀粉样蛋白的聚集,有可能加剧AD的病理过程。然而,Callawayet al.等人研究显示,暴露于七氟醚的幼鼠和老年鼠的学习记忆功能不会受到损害。还有研究则认为七氟醚可以改善患者的术后认知功能。由于实验室研究和动物研究结果存在诸多矛盾,进一步研究常用吸入全麻药七氟醚与AD疾病发生发展的关系,并对相关机制进行探讨显得殊为重要。为此,本项目将以瑞典家系β-淀粉样前体蛋白(APPswe)转基因小鼠为研究模型,建立吸入麻醉AD动物模型,选择临床上最为常用的吸入麻醉药七氟醚,采用分子生物学及行为学等方法,研究七氟醚麻醉对AD模型小鼠学习和记忆功能的影响及其机制,为AD患者和认知功能障碍病人的临床麻醉用药提供理论指导和依据。第一部分APPswe转基因鼠的鉴定及吸入麻醉动物模型的建立目的APPswe转基因鼠的鉴定及建立吸入麻醉动物模型。方法在小鼠出生后10-15天,切尾,使用PCR技术对APPswe转基因小鼠检测APPswe基因表达情况。然后将90只APPswe转基因小鼠随机分成三组:对照组,假手术组,七氟醚吸入组;对照组不进行任何干预,假手术组置于含100%O2麻醉箱中两个小时,七氟醚吸入组置于含(2.5%)七氟醚的100%O2麻醉箱中两个小时。动物自主呼吸,麻醉剂和氧气浓度保持不变。使用电热毯的温度保持在(37±2℃)时,使用直肠温度计每20分钟测定一次。使用非侵入性的血压监测鼠尾套(BP-2000;VisitechSystems,Inc.,Apex,NC,USA)检测血压。使用小动物脉搏血氧仪监测动物的心率和血氧饱和度,麻醉后取动脉血进行血气分析。结果PCR结果显示,APPswe基因表达阳性。APPswe基因PCR产物碱基长344 kb。小鼠麻醉过程中未出现死亡,心率、呼吸等各项生命体征正常。各组实验小鼠心率、呼吸频率和体温均在正常范围。结论通过本研究,我们对APPswe转基因鼠进行了鉴定,成功建立了吸入麻醉转基因动物模型,为后续进行试验奠定了基础。第二部分七氟醚麻醉对APPswe转基因鼠学习记忆功能的影响目的利用Morris水迷宫实验和Y-迷宫实验检测小鼠的学习记忆能力。方法利用Morris水迷宫监测小鼠学习和记忆能力,Morris水迷宫实验装置为一圆形水池,直径约为160厘米,深度50厘米,水深为30厘米,水池壁上以东、南、西、北4个相等距离的点将水池划分为四个同样大小的象限,将一直径约为10 cm的平台固定于水池的东南象限,水平面高出平台1 cm。水温恒定在23±1℃,实验前,将小鼠放置在一个封闭的,安静的,黑暗的环境适应半小时,然后麻醉后24小时,连续五天,每天四次进行定位航行试验(PNT)和空间探索实验(SPT)。由计算机系统记录行踪,经视频分析软件对结果进行处理,统计小鼠游泳速度,逃避潜伏期、原象限滞留时间。Y-迷宫实验:麻醉结束24小时后,在安静,低光环境下,让小鼠进入Y-迷宫,三臂灯被点亮,并让其适应到3分钟后关灯,然后打开小鼠不在一臂灯(随机灯亮),5秒停留(灯亮为安全区),通电剩下两臂(电压45-55V),记录小鼠到达安全区域所用时间(30秒内有效,否则失败)。灯持续亮30秒,然后关闭,一次实验结束,两个实验之间间隔1分钟,随后重复每天固定训练20次,连续三天在同一时间段进行训练。在这个实验中Y-迷宫判断的标准为受电击的小鼠直接跑到安全区被称为“正确反应”,逃到没有亮灯的任何一臂都被认为“错误反应”。观察动物的正确反应的数目(每天20次训练正确的响应次数)和主动回避次数(灯不亮,5s内完成逃避反应的次数)。结果水迷宫实验结果显示,七氟醚麻醉前三组小鼠游泳时间,逃避潜伏期三组之间没有明显差异。七氟醚麻醉后三组间游泳速度亦无明显差异。与对照组比较,吸入纯氧的转基因小鼠逃避潜伏期和原象限滞留时间的差异无显著性(P>0.05),表明吸入纯氧2小时对APPSwe转基因小鼠的学习记忆功无明显影响。然而,七氟醚麻醉组与对照组和假手术组比较,其学习曲线后移,转基因小鼠的逃避潜伏期延长(p<0.01),而小鼠在原来(初始)象限滞留的时间相应缩短(P<0.05),穿越平台的总次数减少(P<0.05),表明暴露于2.5%七氟醚2小时对APPSwe单转基因小鼠的学习记忆能力有损害作用。此外,Y-迷宫实验显示,七氟醚吸入组与假手术组和对照组比较正确反应次数明显减少(P<0.01),主动回避次数亦明显减少,差异有统计学意义(p<0.01)。结论通过Morris水迷宫实验研究发现,七氟醚麻醉能对AD转基因小鼠的学习记忆能力产生明显损害,表现为转基因小鼠的平均逃避潜伏期延长,在初始象限的滞留时间相应缩短,和穿越平台的总次数减少。Y迷宫实验研究发现,七氟醚麻醉组小鼠的正确反映次数和主动回避次数均明显减少,表明七氟醚麻醉能够对AD转基因小鼠的学习记忆能力产生损害。第三部分七氟醚麻醉对APPswe转基因鼠海马神经元凋亡及相关信号通路的影响目的选取转基因小鼠海马CA1区、CA3和DG区进行TUNEL原位末端标记凋亡染色观察部位,观察七氟醚对阿尔兹海默病转基因小鼠海马区神经细胞凋亡的影响,并采用Western Blot法检测线粒体凋亡基因Caspase-3和抑凋亡基因Bcl-xL的表达情况。方法TUNEL实验利用美国Roche凋亡检测试剂盒。戊巴比妥钠对小鼠进行麻醉,脑组织切片包括CA1,CA3和DG三个区域,样品脱蜡、脱水,加入蛋白酶K(Proteinnase K)工作液37℃反应30min,浸入含有5%过氧化氢封闭液中,并在室温下封闭15分钟,再经与制备的TUNEL反应混合物反应、显色反应10分钟,PBS中漂洗封片。最后,观察凋亡细胞,选取五个视野角荧光显微镜拍照计数。Western blotting检测:首先组织蛋白提取,利用Bradford法检测蛋白浓度。配制10%SDS凝胶电泳,用PVDF膜进行转膜,将转好的膜放置于室温下脱色摇床上,再用5%的脱脂牛奶封闭1h,稀释一抗anti-caspase-antibody,anti-Bcl-xLantibody(1:1000)振荡孵育4℃过夜,加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔或小鼠IgG二抗(稀释度为1:2000),室温振荡孵育lh,anti-β-actin单克隆抗体作为内参对照(Cell Signaling),最后用显影、定影试剂进行显影和定影。结果TUNEL检测CA1,CA3和DG区凋亡细胞的数目,结果显示假手术组与对照组相比差异均无统计学意义(P>0,05),而七氟醚吸入组CA1,CA3区凋亡细胞数与假手术组和对照组相比明显增加(P<0.01)。但是,DG区的凋亡细胞数目三组间没有明显差异(P=0.0797)。通过Western blotting检测每个组海马区Bcl-xL和caspase-3蛋白表达水平,用目的蛋白条带灰度值与内参β-actin灰度值之比作为Bcl-xL、caspase-3蛋白的表达水平。结果显示,假手术组与对照组相比Bcl-xL、caspase-3蛋白的表达水平的差异无统计学意义(P>0.05),而七氟醚吸入组与对照组和假手术组比较caspase-3蛋白水平明显增加(P<0.01),Bcl-xL蛋白水平明显降低(P<0.01)。结论七氟醚吸入麻醉小鼠AD模型中,TUNEL实验结果显示七氟醚能够明显增加海马CA1和CA3区神经元的凋亡,加重AD转基因小鼠海马神经元细胞的损害程度。通过Western blotting实验显示七氟醚吸入麻醉组caspase-3蛋白表达水平明显增加,Bcl-xL蛋白表达水平降低。提示七氟醚导致神经细胞凋亡的机制与caspase-3的激活和Bcl-xL的下调有关。